响应面法优化桦褐孔菌总酚的超声提取工艺

李 峰，尚 磊，俞力超，徐秀泉

1江苏大学附属医院，镇江212001;2江苏大学京江学院;3江苏大学药学院，镇江212013

响应面法优化桦褐孔菌总酚的超声提取工艺

李 峰1，尚 磊2，俞力超1，徐秀泉3*

1江苏大学附属医院，镇江212001;2江苏大学京江学院;3江苏大学药学院，镇江212013

以桦褐孔菌总酚得率为指标，在单因素试验基础上，根据中心组合试验设计原理，采用三因素三水平的响应面设计方法对超声提取过程中影响总酚得率的乙醇浓度、超声温度及时间进行优化。结果表明桦褐孔菌总酚超声提取的最佳工艺条件为:采用55%乙醇，料液比1∶30，在52℃下超声提取40 min，在此最佳条件下，总酚得率为19.42 mg/g，实验结果与模型预测值相符，相对误差为+0.78%。

桦褐孔菌;总酚;超声提取;响应面设计

桦褐孔菌(Inonotus obliquus)，又称chaga，从16世纪以来就是俄罗斯、东欧、波兰、芬兰等国家民间广泛应用的药用真菌，用于防治各种疑难杂症，日本研究人员高度评价这种民间药用真菌为“万能药”［1］。桦褐孔菌中主要含有多糖、酚类及三萜类化合物，其中酚类化合物是其主要活性成分，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎等多种药理活性［2-5］。但对桦褐孔菌总酚的提取工艺研究较少。响应面法(response surfacemethodology，RSM)是采用多元二次回归方法作为函数估计的工具，将多因子实验中因素与指标的相互关系用多项式近似拟合，依此可对函数的响应面进行分析，研究因子与响应面之间、因子与因子之间的相互关系［6］。为深入开发该药用真菌，本文在单因素试验的基础上，采用 Box-Behnken中心组合设计方法，响应面法优化桦褐孔菌总酚的超声提取工艺条件，为桦褐孔菌的深入开发提供实验依据。

1 仪器与试药

UV-2550型紫外可见分光光度计(日本岛津公司)，DHG-9145鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司)，KQ—250DB型超声波仪(昆明市超声仪器有限公司)，BS 110 S型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。没食子酸对照品，Folin-Ciocaltean试剂购自Sigma公司，其它试剂均为国产分析纯试剂。桦褐孔菌购自吉林省千百汇土特产有限公司，经江苏大学药学院宋晶博士鉴定为药用真菌Inonotus obliquus干燥菌核，粉碎过筛备用。

2 实验方法

2.1 总酚的测定［7］

2.1.1 没食子酸标准曲线的绘制

精密称取没食子酸对照品25.0 mg，置25 mL量瓶中，加乙醇适量溶解，定容至刻度，摇匀，取上述溶液2.5 mL定容至25 mL量瓶中，即得100 μg/mL没食子酸标准溶液。分别精密量取该标准溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加入Folin-Ciocaltean试剂0.5 mL，振摇1 min，再加入20%碳酸钠溶液2 mL，摇匀，加蒸馏水至刻度，在室温放置2小时。以相应的试剂溶液为空白，按分光光度法，在750 nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得A= 0.0147C-0.0017，R2=0.9994，结果表明没食子酸在浓度10～100 μg/mL范围内与吸光度呈现良好的线性关系。

2.1.2 样品溶液的制备

准确称取1.00 g桦褐孔菌粉末于100 mL具塞锥形瓶中，加入一定浓度的乙醇溶液，在规定温度下超声提取规定时间，离心，定容至25 mL得样品溶液，移取样品溶液适量按照标准曲线项下测定样品吸光度，计算总酚得率。

采用单因素试验考察乙醇浓度、超声时间、超声温度、料液比对桦褐孔菌总酚提取率的影响，依据单因素实验结果确定因素水平范围，利用Design-Expert Software软件为辅助手段设计响应面试验。

3 结果与讨论

3.1 单因素试验

3.1.1 乙醇浓度对总酚提取率的影响

固定料液比1∶30，超声温度50℃，超声时间20 min，考察不同乙醇浓度对桦褐孔菌总酚提取率的影响。结果表明在20%～60%乙醇浓度范围内，总酚提取率随乙醇浓度的增加而有显著提高，在乙醇浓度60%时提取率最大，随着乙醇浓度的进一步增加，总酚提取率显著下降。因此选择60%左右乙醇作为较佳的提取溶剂。

3.1.2 超声提取时间对总酚提取率的影响

固定料液比1∶30，超声温度50℃，乙醇浓度60%，考察不同超声提取时间对桦褐孔菌总酚提取率的影响。结果表明从10到30 min总酚提取率随提取时间的延长而增加，在30 min时达到最大值。再延长超声时间，总酚得率趋于平稳，有下降的趋势，因此选择超声时间在30 min左右为宜。

3.1.3 超声提取温度对总酚提取率的影响

固定料液比1∶30，乙醇浓度60%，超声时间20 min，分别在考察不同超声温度对桦褐孔菌总酚提取率的影响。结果表明在20～50℃范围内，随温度提高总酚得率提高，说明较高的温度对酚化合物的溶出是有利的。当超过50℃后，总酚得率有所下降，选择50℃左右提取较为合适。

3.1.4 料液比对总酚提取率的影响

固定乙醇浓度60%，超声时间20 min，超声温度50℃，按照1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50加入提取溶剂，考察不同料液比对桦褐孔菌总酚提取率的影响。结果表明随料液比的增加，总酚提取率相应增高，这是由于溶剂用量增加，可以使药材与溶剂接触面积增大，并且能够增大固液浓度差，有利于扩散速度的提高。当料液比大于1∶30后，总酚的提取率基本保持不变，本着经济节约原则，选择料液比1∶30为好。

3.2 响应面优化总酚的超声提取条件

3.2.1 响应面实验安排及结果

根据中心组合设计原理，综合单因素实验结果，以乙醇浓度、超声提取温度、超声时间三个因素为自变量，总酚的提取得率为响应值，设计3因素3水平共17个实验点的响应面分析实验。因素水平分析选取见表1。实验方案与结果见表2，其中12个为析因实验，5个为中心实验。

表1 响应面因素水平编码表Table 1 Factors and levels in extraction experiments of total phenols

表2 响应面分析试验结果Table 2 Experimental designs and extraction results of total phenols

2 －1 1 0 18.45 18.57 3 0 1 1 18.14 18.40 4 －1 0 1 18.35 18.22 5 0 －1 1 18.04 18.24 6 0 0 0 18.64 18.62 7 0 0 0 18.59 18.62 8 －1 0 －1 15.01 15.09 9 －1 －1 0 16.68 16.87 10 0 －1 －1 13.60 13.52 11 0 0 0 18.60 18.62 12 1 1 0 17.42 17.23 13 0 0 0 18.56 18.62 14 1 －1 0 15.21 15.08 15 0 1 －1 17.50 17.30 16 0 0 0 18.72 18.62 17 1 0 －1 14.05 14.18

3.2.2 建立模型方程与显著性检验

应用Design-Expert 8.0.5软件对表2中的数据进行二次多元回归拟合，得到乙醇浓度(A)、超声时间(B)、超声温度(C)与桦褐孔菌总酚之间的二次多项回归方程:

对上述回归模型进行显著性检验，结果见表3。

由表3回归方差显著性检验表明，一次项各因素对总酚得率的线性效应极显著;二次项各因素对总酚提取率的曲面效应极显著;比较各因子间交互作用提取时间和提取温度间交互作用极显著，乙醇浓度与提取温度交互作用高度显著，乙醇浓度与提取时间交互作用不显著，各因素交互作用的响应面立体分析图和等高线图见1-3。在本实验设计范围内，回归方程显著性检测P＜0.0001，极显著，模型的确定系数为0.9981，说明该模型能解释99.81%响应值的变化，即该模型与实际实验拟合良好，试验误差小，证明应用响应曲面法优化的提取工艺提取桦褐孔菌总酚是可行的。

表3 桦褐孔菌总酚提取率方差分析结果Table 3 ANOVA for the regression model and respective terms

3.3 提取工艺条件的确定

为确定各因素的最佳取值，利用Design-Expert软件分析后，得出回归模型存在最大值点，(A、B、C)的代码值为(-0.24、0.97、0.18)。与之对应的实测值为乙醇浓度(A)=55.2%，提取时间(B)= 39.7 min，提取温度(C)=51.8℃，此时酚提取得率的最大估计值Y=19.30 mg/g。为实际操作方便，选取乙醇浓度=55%，提取时间=40 min，提取温度=52℃，进行3次平行验证实验，桦褐孔菌总酚得率为 19.42 mg/g，与理论值的相对偏差为+0.78%说明实验值与理论值有较好的拟合性。

4 结论

将单因素实验和响应面分析法结合对超声辅助提取桦褐孔菌总酚的工艺条件进行优化，获得最佳提取工艺条件:采用55%乙醇，料液比1∶30，在52℃下超声提取40 min，在此最佳条件下，总酚得率为19.42 mg/g，实验结果与模型预测值相符。响应面分析法可以很好的对桦褐孔菌总酚超声提取工艺进行优化，试验结果对药用真菌桦褐孔菌的深入研究开发具有很好的理论指导意义。

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2 Nakajima Y，Sato YZ，Konkshi T.Antioxidant Small Phenolic Ingredients in Inonotus obliquus(persoon)Pilat(Chaga) Chem.Pharm Bull，2007，55:1222-1226.

3 Zheng WF，Zhang MM，Zhao YX.NMR-based metabonomic analysis on effect of light on production of antioxidant phenolic compounds in submerged cultures of Inonotus obliquus. Bioresour Technol，2009，100:4481-4487.

4 Nakajima Y，Nishida H，Matsugo S.Cancer Cell Cytotoxicity of Extracts and Small Phenolic Compounds from Chaga Inonotus obliquus(persoon)Pilat.J Med Food 2009，12:501-507.

5 Park YM，Won JH，Kim YH.In vivo and in vitro anti-inflammatory and anti-nociceptive effects of the methanol extract of Inonotus obliquus.J Ethnopharmacol，2005 101:120-128.

6Wang HW(汪洪武)，Liu YQ(刘艳清)，Wang YH(汪远红).Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction of Total Flavonoids from Leaves of the Artocarpus heterophyllus by Response Surface Methodology.Chin Med Mat(中药材) 2011 34:1125-1129.

7 Wang J，Sun BG，Cao YP，et al.Optimisation of ultrasoundassisted extraction of phenolic compounds from wheat bran.Food Chem，2008，(106):804-808.

Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction of Total Phenols from Inonotus obliquus by Response Surface Methodology

LI Feng1，SHANG Lei2，YU Li-chao1，XU Xiu-quan3*1Affiliated Hospital of Jiangsu University Zhenjiang 212001，China;2School of Jingjiang Jiangsu University;3School of Pharmacy Jiangsu University Zhenjiang 212013，China

With the Extraction rate of total phenols as response value the ethanol concentration ultrasonic-assisted extraction temperature and extraction time were optimized by response surface methodology with 3 factors and 3 levels based on single factor experiments.The optimal extraction conditions were ethanol concentration 55%liquid-material ratio of 1∶30 extraction temperature 52℃ and extraction time 40 min for extraction total phenols from Inonotus obliquus.Under these conditions the maximal yield of total phenols reached 19.42 mg/g which was agreed with model predictions for the relative error of+0.78%.

Inonotus obliquus;total phenols;ultrasonic-assisted extraction;response surface methodology

1001-6880(2012)10-1458-05

2011-12-26 接受日期:2012-03-12

镇江市社会发展项目(SH2010033);江苏大学大学生科研立项项目(Y09A098)

*通讯作者 Tel:86-511-85038403;E-mail:xxq781026@sohu.com

R284.2

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