原创中药红珠胶囊基于RRLC-ESI-MS/MS技术的化学成分分析*

彭 维，吴万征，邹 威，朱芳绘，王永刚，王建壮，郭 静

(1.中山大学生命科学学院，广东 广州 510275；2.广东医学院附属医院，广东 湛江 524001；3.广东药学院，广东 广州 510006；4.广东环球制药有限公司，广东 佛山 528303)

红珠胶囊是中山大学研制的中药五类新药，具有止咳、化痰的作用，其内容物为化橘红有效部位。笔者采用RRLC-ESI-MS/MS 技术，首次鉴定了该药中的9个成分，阐明了其化学物质基础，现报道如下。

1 仪器与试药

Agilent 1200SL RRLC-6410QQQ液相-质谱联用仪(美国安捷伦公司)； BP211D电子分析天平(瑞士沙多利斯公司)；KQ-250DE数控超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)。

柚皮苷(供含量测定用，中国药品生物制品检定所，批号110722-200309)；新北美圣草苷(Sigma-Aldrich公司，批号：1326322，纯度98.6%)；野漆树苷(Sigma-Aldrich公司，批号：023H0743，纯度99.0%)；橙皮内酯水合物(云南西力生物技术有限公司提供，批号:5875-49-0-BBP00486，纯度>95%)；樱桃苷(加拿大ChromaDex公司，纯度>98%)；7-(2″-α-鼠李糖基-6″-(3″″-羟基-3″″-甲基戊二酰)-β-D-葡萄糖基)柚皮素(自制，经UV、IR、MS、NMR谱确证)；柚皮素(Sigma公司，货号：N5893-1g，批号：035K1316,纯度97.5%)。红珠胶囊由中山大学广州现代中药质量研究开发中心研制，委托广东环球制药有限公司生产(批号20120501)。

甲醇(色谱纯，霍尼韦尔贸易(上海)有限公司)，甲酸(色谱纯，美国Sigma公司)，水为超纯水。

2 方 法

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 分别取新北美圣草苷、樱桃苷、柚皮苷、野漆树苷、橙皮内酯水合物、7-(2″-α-鼠李糖基-6″-(3″″-羟基-3″″-甲基戊二酰)-β-D-葡萄糖基)柚皮素、柚皮素对照品适量，加甲醇制成每1 mL含新北美圣草苷、樱桃苷、柚皮苷、野漆树苷、橙皮内酯水合物、7-(2″-α-鼠李糖基-6″-(3″″-羟基-3″″-甲基戊二酰)-β-D-葡萄糖基)柚皮素、柚皮素各0.1 mg的混合对照品贮备液，4 ℃冷藏备用。使用时将贮备液稀释100倍作为对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取装量差异项下的胶囊内容物，研细，取0.1 g，精密称定，置100 mL量瓶中,加甲醇约70 mL，超声处理(功率360 W，频率35 kHz)30 min，放冷至室温,用φ=50%甲醇稀释至刻度，摇匀。取上述溶液，适当稀释，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2 RRLC-ESI-MS/MS分析

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(3.5 μm，150 mm×3.0 mm)；柱温30 ℃；流动相为甲醇-甲酸溶液(pH=3.0)，0～50 min：甲醇(φ)：30%→60%，甲酸溶液(φ)：70%→40%；流速0.3 mL/min；进样量：5 μL。

2.2.2 质谱条件 电喷雾电离源：ESI，正、负离子模式检测，干燥氮气温度350 ℃，流量12.0 L/min，雾化气压力40 psi，毛细管电压4 000 V，扫描质量范围m/z100～1 500。

3 结 果

样品在RRLC-MS/MS正模式和负模式下进行分析，结果见图1、表1。

图 1 红珠胶囊正模式(A)和负模式(B)的总离子流图Fig.1 Total Ion current of positive mode(A) and negative mode(B) of Hongzhu Capsule

通过紫外光谱特征、质谱中分子离子峰和碎片离子峰的精确相对分子质量匹配、保留时间对比、结合文献查阅等信息，以及与对照品比较，确证和指认了红珠胶囊中9个成分，具体如下。

3.1 新北美圣草苷(Neoeriocitrin)

检测到[M+H]+准分子离子峰为m/z597.5，对其进行子离子扫描(PI)，得到m/z289.1，为糖苷键断裂产生。[M-H]-准分子离子峰为m/z595.0，对其进行子离子扫描(PI)，得到m/z459.3为C环进行RDA裂解，然后丢失一个羰基产生；m/z287.0为糖苷键断裂产生；m/z150.8为糖苷键断裂后C环进行RDA裂解再丢失一个羰基所产生的。在液质联用中，与对照品的相对保留时间、分子离子峰和碎片离子峰的精确相对分子质量、质谱断裂行为一致，经与文献[1-2]比对，确证该化合物为新北美圣草苷，分子式为C27H32O15。

3.2 樱桃苷(Prunin)

检测到[M+H]+准分子离子峰为m/z435.4。[M-H]-准分子离子峰为m/z433.0，对其进行子离子扫描(PI)，得到m/z271.0及m/z150.7。其中m/z271.0为糖苷键断裂产生，m/z150.7为糖苷键断裂后C环进行RDA裂解，然后丢失一个H所得。在液质联用中，与对照品的保留时间、分子离子峰和碎片离子峰的精确相对分子质量、质谱断裂行为一致，经文献[2-3]比对，确证该化合物为樱桃苷，分子式为C21H22O10。

表1 红珠胶囊化学成分分析(正模式和负模式)Table 1 Chemical Constituent Analysis in Hongzhu Capsule(positive and negative modes)

注：7-(2″-α-鼠李糖基-6″-(3″″-羟基-3″″-甲基戊二酰)-β-D-葡萄糖基)柚皮素(Melitidin)

3.3 柚皮苷(Naringin)

检测到[M+H]+准分子离子峰为m/z 581.3。[M-H]-准分子离子峰为m/z579.0，对其进行子离子扫描(PI)，得到m/z459.0为C环进行RDA裂解丢失苯酚基和一个羰基产生；m/z271.1为柚皮苷配基-7-O-葡糖苷的糖苷键断裂产生。在液质联用中，与对照品的保留时间、分子离子峰和碎片离子峰的精确相对分子质量、质谱断裂行为一致，经文献[1-3]比对，确证该化合物为柚皮苷，分子式为C27H32O14。

3.4 忍冬苷(Lonicerin)

检测到[M+H]+准分子离子峰为m/z595.0。[M-H]-准分子离子峰为m/z593.0，对其进行子离子扫描(PI)，得到m/z284.8为忍冬苷的糖苷键断裂产生的；m/z151.0为糖苷键断裂后C环进行RDA裂解所产生的。在液质联用中，根据分子离子峰和碎片离子峰的精确相对分子质量、质谱断裂行为与文献[4]比对，指认该化合物为忍冬苷，分子式为C27H30O15。

3.5 野漆树苷(Rhoifolin)

检测到[M+H]+准分子离子峰为m/z579.0。[M-H]-准分子离子峰为m/z577.1，对其进行子离子扫描(PI)，得到m/z269.1为野漆树苷的糖苷键断裂产生。在液质联用中，与对照品的保留时间、分子离子峰和碎片离子峰的精确相对分子质量、质谱断裂行为一致，经文献[1-3]比对，确证该化合物为野漆树苷，分子式为C27H30O14。

3.6 橙皮内酯水合物(Meranzin hydrate)

检测到[M+H]+准分子离子峰为m/z278.9，对其进行子离子扫描(PI)，得到m/z261.0，m/z243.2，m/z189.1及m/z131.0。m/z261.0为橙皮内酯，支链断裂形成苯骈呋喃离子m/z189.1，丢失一个甲氧基和一个羰基产生m/z131.0。在液质联用中，与对照品的保留时间、分子离子峰和碎片离子峰的精确相对分子质量、质谱断裂行为一致，经文献[3,5-6]比对，确证该化合物为橙皮内酯水合物，分子式为C15H18O5。

3.7 7-(2″-α-鼠李糖基-6″-(3″″-羟基-3″″-甲基戊二酰)-β-D-葡萄糖基)柚皮素(Melitidin)

检测到[M+H]+准分子离子峰为m/z724.2。[M-H]-准分子离子峰为m/z722.7，对其进行子离子扫描(PI)，得到m/z620.8、m/z578.9及m/z270.9，其中m/z620.8为酯键断裂产生，再丢失一个乙酰基产生m/z578.9， Melitidin的酯键、糖苷键断裂形成柚皮素m/z270.9。在液质联用中，与Melitidin的保留时间、分子离子峰和碎片离子峰的精确相对分子质量、质谱断裂行为一致，经文献[1]比对，确证该化合物为Melitidin，分子式为C33H40O18。

3.8 柚皮素(Naringenin)

检测到[M+H]+准分子离子峰为m/z273.2。[M-H]-准分子离子峰为m/z271.0，对其进行子离子扫描(PI)，得m/z150.9及m/z106.9。其中m/z150.9为C环进行RDA裂解丢失苯酚基和一个羰基产生，m/z106.9为A环断裂、C环RDA裂解产生。在液质联用中，与对照品的保留时间、分子离子峰和碎片离子峰的精确相对分子质量、质谱断裂行为一致，经文献[1,3]比对，确证该化合物为柚皮素，分子式为C15H12O5。

3.9 异橙皮内酯(Isomeranzin)

检测到[M+H]+准分子离子峰为m/z261.0，对其进行子离子扫描(PI)，得到m/z243.1，m/z189.0及m/z131.2。支链断裂形成苯骈呋喃离子m/z189.0，丢失一个甲氧基和一个羰基产生香豆素类化合物的特征离子m/z 131.2。在液质联用中，根据保留时间、分子离子峰和碎片离子峰的精确相对分子质量、质谱断裂行为，经文献[3,5-6]比对，指认该化合物为异橙皮内酯，分子式为C15H16O4。

4 讨 论

经过RRLC-MS/MS分析，确证和指认了红珠胶囊中7个黄酮类成分(新北美圣草苷、樱桃苷、柚皮苷、忍冬苷、野漆树苷、Melitidin、柚皮素)和2个香豆素类成分(橙皮内酯水合物、异橙皮内酯)。本研究揭示了红珠胶囊的化学物质基础，有利于监控该药的质量[7]。

[1] ZHANG M X，DUAN C Q， ZANG Y Y，et al. Theavonoid composition ofavedo and juice from the pummelo cultivar (Citrusgrandis(L.) Osbeck) and the grapefruit cultivar (Citrusparadisi) from China[J]. Food Chemistry，2011，129：1530-1536.

[2] GALL L G, DUPONT S M, MELLON A, et al. Characterization and content of flavonoid glycosides in genetically modified tomato (Lycopersiconesculentum) fruits [J].Journal of Agriculture and Food Chemistry, 2003, 51：2438-2446.

[3] 刘群娣，谢春燕，闫李丽，等．化橘红化学成分的HPLC-DAD-MS/MS分析[J].世界科学技术:中医药现代化，2011，13(5)：864-867.

[4] 刘芳，舒积成，潘景行，等．忍冬苷的合成及其对雷公藤甲素诱导肝损伤的保护作用[J].中国实验方剂学杂志，2012，18(5)：72-75.

[5] 牛艳，王磊，黄晓君，等．化橘红香豆素类的化学成分[J].暨南大学学报:自然科学与医学版，2012,18(5)：501-505.

[6] 古淑仪，宋晓虹，苏薇薇.化州柚中香豆素成分的研究[J].中草药，2005，36(3):341-343.

[7] 彭维，苏薇薇，古淑仪，等.原创中药红珠胶囊的质量标准研究[J].中山大学学报:自然科学版，2013，52(6)：110-113.