双酶法制备螺旋藻多肽的工艺研究

孙宜君，常 蓉，张 娇，刘士伟，李博生

1北京林业大学生物科学与技术学院;2北京林业大学螺旋藻研究所，北京100083

双酶法制备螺旋藻多肽的工艺研究

孙宜君1，常 蓉1，张 娇1，刘士伟1，李博生2*

1北京林业大学生物科学与技术学院;2北京林业大学螺旋藻研究所，北京100083

选用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶结合的双酶法对螺旋藻蛋白进行水解。其中，对木瓜蛋白酶水解螺旋藻蛋白的工艺进行优化。以水解度为指标，研究了酶解时间、酶与底物比、pH和酶解温度4种因素对酶解反应的影响。在此基础上设计了3因素(加酶量、酶解温度和pH)3水平的响应面试验。结果表明碱性蛋白酶水解螺旋藻蛋白的最佳酶解条件为:加酶量4300 U/g，pH 7.0，酶解温度55℃，酶解时间160 min;木瓜蛋白酶的最佳酶解条件为:酶底比为4.5%，酶解温度60℃，pH 6.5，酶解时间210 min。利用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶结合的双酶法制得的多肽水解度可达32.90%，与单酶法相比，水解度明显提高。

螺旋藻肽;碱性蛋白酶;木瓜蛋白酶;水解条件

螺旋藻(Spirulina)是一类单细胞生物，属于蓝藻门颤藻科螺旋藻属。其中，极大螺旋藻(S.Maxcima)和钝顶螺旋藻(S.Platensis)是应用于生产的主要藻种。螺旋藻富含营养，蛋白质含量高达50%～70%，氨基酸组成比例合乎人体的需求，是一种极好的蛋白质来源［1］。近年来的研究发现，人类摄取蛋白质经消化酶作用后，并非主要以氨基酸的形式吸收，而是以肽的形式吸收。一些多肽同时具有免疫调节、抗氧化、降血压、抗菌等多种生理功能［2］。利用酶法水解制备生物活性肽已经成为近年来研究的新热点，其具有反应条件温和、专一性强、反应进程容易控制和无不良副反应等优点［3］。对螺旋藻蛋白质进行水解有利于提高蛋白质的溶解性和吸收利用率，螺旋藻蛋白质酶解后形成多肽及小分子肽，能被人体快速吸收［4］。本研究选用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶结合的双酶法对螺旋藻蛋白进行水解，为提高螺旋藻中蛋白质资源的利用效率、研究螺旋藻多肽生理活性奠定了基础，对螺旋藻的综合利用具有重大意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

钝顶螺旋藻粉Spirulina platensis(蛋白质含量＞60%，水分＜7%)，由北京林业大学螺旋藻研究所提供;考马斯亮蓝G-250，AMRESCO公司出品;硫酸铵为分析纯，北京化学试剂公司生产;甲醛溶液为分析纯，汕头市西陇化工有限公司出品;碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶均为分析级，美国sigma公司生产。

1.2 仪器与设备

7-A2004型电子天平，上海民桥精密科学仪器有限公司制造;SHK-99-II型台式空气恒温摇床，北方同正生物技术发展公司出品;DSY-2-8型电热恒温水浴锅，北京国华医疗机械厂制造;GL-20G-II型冷冻离心机，上海安宁科学仪器厂生产;LL-1500型真空冷冻干燥机，赛默飞世尔科技(中国)有限公司出品。

1.3 实验方法

1.3.1 螺旋藻蛋白的制备

利用反复冻融结合超声波法制备螺旋藻蛋白［5-6］。具体步骤为:将适量螺旋藻干粉以1∶10的比例加入蒸馏水制成螺旋藻悬浮液，超声波细胞破碎仪超声处理(功率700 W，超声处理10 s，间隔10 s，共超声处理20 min)。超声处理后，用液氮将螺旋藻液冷冻，之后于37℃水浴中解冻，反复5次冻融后再重复超声处理。收集螺旋藻溶液，4℃下8000 rpm离心20 min，收集上清液。上清液加入NH4SO4至50%饱和度，4℃下8000 rpm离心20 min，收集沉淀。以浓度0.005 M，pH6.86的磷酸盐缓冲液复溶，4℃下于去离子水中透析，透析终点用BaCl2检测予以确定，真空冷冻干燥得到螺旋藻蛋白。

1.3.2 螺旋藻蛋白的水解

先使用碱性蛋白酶水解螺旋藻蛋白，水解完毕后在85℃水浴中灭酶20 min，再按照木瓜蛋白的水解条件进一步水解。水解结束后于85℃水浴中灭酶20 min，4℃ 下8000 rpm离心20 min后，收集上清液冷冻干燥备用。

1.3.3 水解度的测定

采用甲醛滴定法。

2 结果与分析

2.1 单酶和双酶水解螺旋藻蛋白对其水解度的影响

以水解度为指标，对碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、双酶法A(先加入木瓜蛋白酶再加入碱性蛋白酶)和双酶法B(先加入碱性蛋白酶再加入木瓜蛋白酶)处理下螺旋藻蛋白的水解度大小进行比较实验，结果如表1。

表1 不同酶处理下螺旋藻蛋白水解度大小的比较Table 1 Comparison of the degree of Spirulina protein hydrolysis under different enzyme treatment

由表1可看出，双酶法B得到的蛋白水解度最高，这可能是由于两种酶对对方水解产物的水解程度不同造成的。双酶法B与其他三种方法相比，其水解度增加率如表2所示。

表2 水解度增加率Table 2 the incresing rate of DH

根据以上结果选择双酶法B(先加入碱性蛋白酶再加入木瓜蛋白酶)作为酶解方法进行实验。

2.2 木瓜蛋白酶水解螺旋藻蛋白的工艺条件

根据文献，选择碱性蛋白酶的水解条件为:水解时间为160 min，温度为55℃，pH为7.0，加酶量为4300 U/g［7］。

木瓜蛋白酶水解条件的确定实验，使用底物为经过碱性蛋白酶水解后的水解液，以此来观察酶与底物比例、温度(℃)、pH、时间(min)对水解度的变化情况。

2.2.1 酶与底物浓度的比例对水解程度的影响

选取水解时间为210 min，水解pH为6.5，水解温度为60℃三个因素不变，分别选取酶与底物比例(E/S，W/W)为:2%、3%、4%、5%、6%进行水解实验。结果见图1。

图1 酶底比对螺旋藻蛋白水解度的影响Fig.1 Effects of concentration of substrate on degree of hydrolysis

由图1可知，在底物浓度一定的情况下，酶与底物比例为2%～5%时，随着酶用量的增加，水解度在不断上升，而酶与底物比例为5%～6%时，随着酶用量的增加，水解度呈现下降趋势。这可能是由于酶与底物接触达到饱和，过多的酶之间相互抑制的原因。所以，再继续添加水解酶，水解度将不再增加而出现下降的趋势。因此，最适酶与底物比例是5%。

2.2.2 温度对水解程度的影响

选取水解时间为210 min，水解pH为6.5，酶与底物比例为5%(E/S，W/W)三个因素不变，分别选取水解温度为:50、55、60、65、70℃进行水解实验。结果见图2。

图2 温度对螺旋藻蛋白水解度的影响Fig.2 Effects of temperature on the degree of hydrolysis

由图2可知，不同温度对酶解过程影响较大，在水解温度较低时，即50～60℃之间，随着温度的增加水解度也在增加，但当温度过高时，即60℃之后，水解度呈现较快的下降趋势。这与温度过高导致酶失活有关。因此，最适温度为60℃。

2.2.3 pH值对水解程度的影响

选取水解时间为210 min，水解温度为60℃，酶与底物比例为5%(E/S，W/W)三个因素不变，分别选取水解pH值为:5.5、6.0、6.5、7.0、7.5进行水解实验。结果见图3。

图3 pH值对螺旋藻蛋白水解度的影响Fig.3 Effects of pH value on the degree of hydrolysis

由图3可知，pH值过高或过低都会使水解效果下降。pH值在5.5～6.5之间时，水解度随着pH值的升高而增加，而pH值在6.5～7.5之间时，水解度随着pH值的升高而不断下降。这与酶在过高或过低pH值时活力会下降有关。因此，最适pH值为6.5。

2.2.4 时间对水解程度的影响

选取水解pH为6.5，水解温度为60℃，酶与底物比例为5%(E/S，W/W)三个因素不变，分别选取水解时间为:60、90、120、150、180、210、240、270 min进行水解实验。结果见图4。

图4 时间对螺旋藻蛋白水解度的影响Fig.4 Effects of time on the degree of hydrolysis

由图4中可知，随着时间的延长，水解度也在不断增加，当水解时间达到210 min后水解度基本保持稳定，不再升高。这可能是由于水解到一定程度后，底物减少和酶与酶之间形成竞争造成的。所以水解时间为210 min较为合适。

2.3 响应面分析优化水解工艺条件

2.3.1 响应面分析法试验设计及结果分析

根据单因素实验的结果，采用Box-Behnken模型，以酶与底物比例A，水解温度B，pH值三个因素为自变量，并以+1、0、-1分别代表自变量的高、中、低水平，对自变量进行编码，水解度Y为响应值。通过使用统计软件Design-Expert对响应曲面进行分析，同时对结果进行方差分析。响应面分析因素及水平安排见表3。

表3 应面分析因素及水平Table 3 Analytical factors and levels for RSA

综合单因素实验结果，选取了影响水解度大小的三个显著因素即:酶底比、温度、pH，按照Box-Behnken模型，利用统计软件Design-Expert进行了三因素三水平的响应面试验设计，其试验设计方案及结果见表4:

运用Design-Expert软件对表4中的响应面试验结果进行二次回归分析，拟合得到回归方程为:

Y=5.75+0.17×A+0.023×B+0.055×C-0.072×A×B-0.064×A×C+0.070×B×C-0.15× A2-0.17×B2-0.20×C2

为了检验方程的有效性，对双酶法水解螺旋藻蛋白的数学模型进行了方差分析，分析结果见表5，模型系数显著性检验见表5。

表4 试验设计方案与结果Table 4 Program and experimental ental results of RSA

表5 二次响应面回归模型方差分析Table 5 ANOVA of the regression model of quadratic response surface

由表5可知，总的模型“Pr＞F”的值小于0.05，表明二次方程模型显著。回归方程的失拟项的检验P=0.6684＞0.05，不显著，表明未知因素对试验结果干扰很小，同时回归方程的复相关系数 R2= 0.9261，说明因变量与所有自变量之间的回归关系显著，表明该回归方程与实际情况拟合的很好。这较好地反映了水解度与酶底比、温度及pH值的关系，所以可以说该回归方程能较好的预测木瓜蛋白酶水解螺旋藻蛋白的水解度随这三个影响因素的变化规律。

表6 二次响应面回归模型系数显著性检验结果Table 6 Test result of significance for the regression model of quadratic response surface

由表6可知，模型一次项A影响极显著(P＜0.01);A2、B2、C2影响显著(P＜0.05);一次项B、C和交互项AB、AC、BC影响均不显著。即:酶与底物比例对水解度大小的影响极其显著;酶与底物比例、温度、pH的二次项对水解度大小的影响比较显著;三个因素的交互项对木瓜蛋白酶水解螺旋藻蛋白水解度的大小影响不显著。

2.3.2 响应曲面的分析与优化

为了更直观的看出所有因素中的两个因素同时对水解度的大小的影响，可令除了要观察的两项外的其它因素水平值为0，这样可以得到两个因素的交互影响的效果图，经过对得到的二元二次方程的分析，可以绘制出相应的响应面图。见图5、图6和图7。

图5 温度和酶底比对水解反应交互作用影响的响应面图Fig.5 Response surfaces for effects of enzyme dosage and hydrolysis temperature and their mutualinter action on degree of hydrolysis

由图5所示，该响应面开口向下，水解度先是随着酶与底物比例和温度的增加而升高，二者有较为明显的交互作用，当温度和酶与底物比例达到一定数值后曲面趋于平缓。从整个曲面来看，水解度的变化随着酶与底物比例的变化呈现的曲线较陡，而随着温度的变化呈现的曲线较平缓。这说明酶与底物比例的变化相对于温度的变化来讲，其对水解度的大小影响较为明显。

图6 pH值和酶底比对水解反应交互作用影响的响应面图Fig.6 Response surfaces for effects of enzyme dosage and reaction pH value and their mutualinter action on degree of hydrolysis

由图6所示，该响应面开口向下，水解度先是随着酶与底物比例和pH值的增加而升高，二者有着较为明显的交互作用，当pH值和酶与底物比例达到一定数值后曲面变得趋于平缓。从整个曲面来看，水解度的变化随着酶与底物比例的变化呈现的曲线较陡，而随着pH值的变化呈现的曲线较为平缓。这说明酶与底物比例的变化相对于pH值的变化来讲，其对水解度的大小影响较为明显。

图7 pH值和温度对水解反应交互作用影响的响应面图Fig.7 Response surfaces for effects of reaction pH value and hydrolysis temperature and their mutualinter action on degree of hydrolysis

由图7所示，该响应面开口向下，水解度先随着pH值和温度的增加而升高，二者有着明显的交互作用，当pH值和温度达到一定数值后曲面变得趋于平缓。从整个曲面来看，水解度的变化随着pH值的变化和温度的变化呈现的曲线都较为平缓。这说明pH值的变化和温度的变化对水解度大小的影响程度均不是很明显。

2.3.3 水解工艺条件的优化和验证

采用Box-Behnken模型进行响应面设计得到回归方程，再对该模型进行二次回归分析，各因素对水解度的影响大小顺序为:A＞C＞B，即依次为:E/S、pH值、温度。由回归方程计算得出木瓜蛋白酶水解螺旋藻蛋白的最佳工艺条件为:水解时间为210 min，温度为59.80℃，pH值为6.52，酶与底物比例(E/S)为4.55%，理论可得水解度值为33.57%。

根据得到的最佳工艺条件数值进行取整处理，即:水解时间为210 min，温度为60℃，pH值为6.5，酶与底物比例(E/S)为4.5%。按照调整后的工艺条件进行重复实验得到实际水解度值为32.90%，比理论值低0.67%，说明该回归模型具有较高的可靠性。

3 讨论

酶解法生产多肽产品安全性高，生产条件温和，易控制。李欣悦［8］通过不同蛋白酶对内蒙古螺旋藻蛋白的酶解工艺优化的研究，得出四种蛋白酶对螺旋藻的水解能力在各自的最适条件下依次是木瓜蛋白酶﹥碱性蛋白酶﹥胃蛋白酶﹥胰蛋白酶。木瓜蛋白酶水解螺旋藻时其水解度显著高于其他三种，胰蛋白酶水解效果最差，这可能说明胰蛋白酶专一性强，水解位点少，而木瓜蛋白酶水解切割分解点多。王辰［9］等研究过木瓜蛋白酶对螺旋藻蛋白的水解作用，采用茚三酮比色法测定水解度。确定木瓜蛋白酶酶解螺旋藻蛋白的最适宜工艺参数为:温度55℃，酶与底物比0.4%，时间3 h，pH值6.0，此时水解度高达 82.6%，与本实验所得水解度32.90%相差较大，这可能与本实验中采用的水解度测定方法—甲醛滴定法本身的灵敏度偏低有关，有关报道认为它比茚三酮比色法的灵敏度要低两个数量级［10］。此外，对于茚三酮法，它采用单一氨基酸作为标准进行测定，而不同的氨基酸对茚三酮的显色度有偏差，并且比色测定时读数不稳定，很难读出一个确切的数值，因此所得结果可能存在偏差，且该结果也与其他学者［8，11，12］在利用木瓜蛋白酶酶解螺旋藻蛋白研究中所得水解度大小有较大差异，数据准确性有待考量。

本实验采用双酶法制备螺旋藻小分子肽，其水解度比利用单酶处理得到的水解度有明显提高，可能说明利用双酶法进行水解时，第二种酶可以利用前一种酶水解后的产物为底物再进行二次水解，或者是对前一种酶没有水解的剩余螺旋藻蛋白进行了水解，这都会使蛋白水解度得到提高，使螺旋藻蛋白水解更彻底。同时，水解度的提高使螺旋藻蛋白质转化为肽的概率更高，肽的产率也将得到提高。生物活性肽的研制作为国际上新兴的生物高科技产业领域，是具有极大市场潜力的朝阳产业，而螺旋藻是极易大规模化工业养殖的高蛋白质单细胞体，通过双酶法制备螺旋藻活性肽可提高营养成分的吸收利用率，提升产品附加值，并且为进一步从螺旋藻蛋白中分离纯化出功能性多肽奠定了基础。

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Study on Preparation of Peptides from Spirulina Protein with Double Enzyme Method

SUN Yi-jun1，CHANG Rong1，ZHANG Jiao1，LIU Shi-wei1，LI Bo-sheng2*1School of Biology Science and Technology，Beijing Forestry University;2Spirulina institute，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China

Spirulina Protein was hydrolyzed by the combination of alkaline and papain proteinase.The hydrolysis conditions of papain were determined and optimized.The effects of enzyme dosage，temperature，pH and time on degree of hydrolysis were studied in single factor test.On this basis，response surface method(RSM)with three factors(enzyme dosage，temperature and pH)and three levels was designed.The result showed that the optimum conditions of alkaline were:enzyme dosage 4300 U/g，temperature 55℃，time 160 min and pH 7.0;the optimum conditions of papain were: enzyme dosage(E/S)4.5%，temperature 60℃，time 210 min，and pH 6.5.Spirulina protein can be effectively degradated into peptides by the combination of the two enzymes，and DH reached 32.90%，which was significantly higher than that obtained by single enzyme hydrolysis.

Spirulina peptides;alkaline;papain;hydrolysis conditions

1001-6880(2012)10-1468-07

2012-02-20 接受日期:2012-05-30

国家林业公益性行业科研专项(200704025);教育部重点研究项目(102023)

*通讯作者 Tel:86-013466711874;E-mail:Libs7321@126.com

Q949.22

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