人SPK1基因的重组腺病毒载体感染效率及表达特性研究

杨 阳，马 嵘，张 远，刘郁东，汪 敏，孙圣刚，黎 钢＊

（1.华中科技大学同济医学院附属协和医院 神经内科，湖北 武汉430022；2.华中科技大学同济医学院药理学系，湖北 武汉430030）

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种渐进性大脑退行性病变，是最常见的成年痴呆类型，其发病率随年龄增长逐渐升高。迄今确切的病因与发病机制尚未充分阐明，尚无有效的根治良策。近年来神经鞘脂代谢异常与β淀粉样蛋白（amyloid beta－protein，Aβ）的神经毒性作用受到诸多研究者的关注［1－3］。神经鞘脂代谢物包括神经酰胺（ceramide，Cer）、鞘氨醇（sphingosine，Sph）、1－磷酸鞘氨醇（sphingosine 1＿phospate，S1p）等多种代谢产物，目前证明这些代谢产物参与细胞增殖与凋亡的调控。Cer和Sph是细胞增殖的负调控因子，能够抑制细胞生长促进细胞凋亡；而进一步的代谢产物S1p则刺激细胞生长，抑制细胞凋亡［4］。有人将Cer、Sph和S1p称为“鞘磷脂变阻器”，SPK是“鞘磷脂变阻器”的关键调节因子，SPK将Sph转化为S1p。国外研究发现，Aβ25－35诱导SH－SY5Y细胞凋亡过程中SPK1活性减低，提示其活性下降参与AD的发病机制，体外高表达SPK1能否减轻Aβ对神经元的损伤值得进一步研究。腺病毒表达载体是目前重要的转基因病毒载体，可以高效介导基因体内外转移。鉴此，我们成功构建了Ad－CMV－SPK1，本文主要研究Ad－CMV－EGFP对N2a细胞感染的量效与时程变化，以及Ad－CMV－SPK1在N2a细胞中的表达情况，为进一步研究SPK1的生物学功能提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料携带人SPK野生型基因pcDNA3＊SPKWT（FLAG）质粒由军事医学科学院放射医学研究所段海峰老师惠赠；N2a细胞由本实验室保存；高糖DMEM培养基和OPTI－MEM培养基以及胎牛血清均购自GIBCO公司；Ad－CMV－EGFP和Ad－CMV－SPK1由上海吉凯基因科技有限公司协助构建完成，激光共聚焦显微镜（Olympus FV500，日本）；流式细胞仪（BD公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 重组腺病毒对N2a细胞的感染效率研究

1.2.1.1 不同感染滴度的重组腺病毒 Ad－CMV－EGFP感染N2a细胞72h后感染效率。

在96孔板中接种5×103个／孔N2a细胞，待细胞融合率为60%－70%时，分别加入 MOI为0、2.5、5、10、25、50、100的 Ad－CMV－EGFP感染 N2a细胞。72h后在激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白表达，并以流式细胞仪检测绿色荧光阳性细胞百分率作为感染效率的判定指标，以确定适宜的MOI。

1.2.1.2 重组腺病毒 Ad－CMV－EGFP感染 N2a细胞感染效率时程变化 以MOI为25的Ad－CMVEGFP感染N2a细胞后不同时间（24h、48h、72h和96h）收集细胞，经流式细胞仪检测其感染效率。

1.2.2 重组腺病毒介导的人SPK1基因在N2a细胞中的表达

细胞分为三组：第1组为对照组（未感染病毒组），第2组为感染空病毒组，第3组为感染Ad－CMV－SPK1组。在6孔板接种N2a细胞感染72h后收集各组细胞，用裂解液处理提取蛋白，进行Western blot鉴定。

1.3 统计学方法

数据以±s表示，采用SPSS软件包进行t检验。

2 结果

2.1 重组腺病毒对N2a细胞的感染效率的研究

2.1.1 不同感染滴度的重组腺病毒 Ad－CMVEGFP感染N2a细胞72h感染效率

用不同感染滴度的腺病毒Ad－CMV－EGFP感染N2a细胞后72h收集细胞经流式细胞仪定量检测了其感染效率，并在共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白表达。重组腺病毒载体对N2a细胞的感染效率在一定范围内随着MOI的增加而增高（表1）；MOI为100时共聚焦荧光显微镜下几乎100%的细胞均呈绿色（图1），流式细胞仪测其感染率高达99.7%（图2）。MOI为25时感染效率为99.3%（图3），我们选用MOI＝25为后续实验的感染滴度。

表1 不同滴度Ad－CMV－EGFP感染N2a细胞72小时感染效率（±s）

表1 不同滴度Ad－CMV－EGFP感染N2a细胞72小时感染效率（±s）

注：n＝3，＊＊与前一组比较P＜0.001，＊＊＊与前一组比较P＜0.0001

MOI（pfu／cell） 细胞绿色荧光蛋白阳性百分率1.0 55.70±0.776 2.5 70.00±3.758＊＊＊5.0 83.90±1.229＊＊＊10.0 94.50±0.954＊＊25.0 98.03±0.721 50.0 99.33±0.175 100.0 99.57±0.133

图1 重组腺病毒（MOI＝100）感染N2a细胞72h共聚焦显微镜观察

图2 重组腺病毒（MOI＝100）感染N2a细胞72h流式细胞仪检测感染率

2.1.2 重组腺病毒 Ad－CMV－EGFP感染 N2a细胞感染效率时程变化 以MOI＝25的Ad－CMVEGFP感染N2a细胞后，于不同时间收集细胞，以流式细胞仪检测其感染效率（表2）。以MOI＝25的滴度感染N2a细胞24小时感染率为（22.30±0.186）%，48小时感染率为（76.63±1.041）%，72小时达到峰值，96小时有所下降（P＜0.05）。

图3 重组腺病毒（MOI＝25）感染N2a细胞72h流式细胞仪检测感染率

表2 重组腺病毒Ad－CMV－EGFP感染N2a细胞感染效率的时程变化（±s）

表2 重组腺病毒Ad－CMV－EGFP感染N2a细胞感染效率的时程变化（±s）

注：n＝3，＊代表与前一组比较P＜0.05，＊＊＊代表与前一组比较P＜0.0001

时间（h） 感染效率24 22.30±0.186 48 76.63±1.041＊＊＊72 98.03±0.722＊＊＊96 94.80±0.231＊

2.2 重组腺病毒感染N2a细胞，SPK1蛋白 Western blot鉴定

重组腺病毒感染N2a细胞72h进行Western blot鉴定，结果如图4所示，感染 Ad－CMV－SPK1组与对照组和空病毒组相比，蛋白表达量显著增高，因其在约72KD处有融合蛋白（SPK1－EGFP）的表达。

图4 重组腺病毒感染N2a细胞72h后，SPK1蛋白Western blot检测

3 讨论

SPK是调控细胞生命活动的一个重要代谢酶，目前SPK家族共有8个同工酶被克隆和鉴定，其中SPK1和SPK2源自人类和小鼠［5］。SPK1主要分布在脑、肺、心脏、脾脏和肝脏。SPK2比SPK1多200个氨基酸，主要分布在肝脏和心脏［6］。SPK1的催化产物S1p是一个新发现的同时具有细胞内第二信使和细胞外第一信使双重功能的脂类生物活性分子［7］。SPK1／S1p在抗细胞凋亡中具有最要地位，其在神经系统变性疾病如AD的地位受到众多研究者的关注，Gomez［8］2007年发现在 Aβ25－35诱导SH－SY5Y细胞凋亡过程中SPK1活性减低的结果，推测SPK1活性的下降可能参与AD发病机制，并采用脂质体转染SPK1质粒可以减轻细胞损伤，提示调节其活性将有助于AD的治疗。

腺病毒载体因具高感染效率等诸多优点，已成为基因治疗领域中最有应用前途的载体系统。本研究通过感染效率实验确定了适宜的MOI，重组腺病毒载体Ad－CMV－EGFP感染N2a细胞72小时，流式细胞仪和激光共聚焦检测结果表明 MOI＝100时，感染效率高达（99.57±0.133）%，MOI＝25时感染效率为（98.03±0.721）%，我们选择 MOI＝25感染N2a细胞，72小时内感染效率随时间升高，72小时达到峰值，96小时略有下降（P＜0.05）。我们将Ad－CMV－SPK1感染N2a细胞，通过western blot检测SPK1在N2a细胞有效表达。本研究结果表明：①重组腺病毒载体对N2a细胞具有很高的感染效率。②重组腺病毒载体感染N2a细胞在72－96小时内感染效率较高。③腺病毒载体具有高效转导基因功能。

本研究确定了携带人SPK1基因的重组腺病毒基因在N2a细胞中具较高的感染效率及基因表达特性，为进一步研究SPK1与阿尔茨海默病之间的关系提供了可靠的实验基础。

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