脐带间充质干细胞的培养及生物学特性

贾芙蓉，何 欣，丁 旭，王 辉，张明明，杨旭红

（1.解放军第二〇八医院，吉林 长春130062；2.吉林省出入境检验检疫局）

间充质干细胞（MSCs）是中胚层发育的早期细胞，为多能干细胞的一种。它最早发现于骨髓中，具有向三种胚层细胞分化的多向分化潜能［1］。近年来，随着细胞生物技术的发展，干细胞移植已经在临床开始应用，间充质干细胞成为人们研究的热点。本实验从脐带分离培养出MSC，并对其形态、免疫表型等基本特性进行研究，为干细胞来源和临床应用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

α－MEM 培养基（Sigma，USA），PBS（北京博奥森生物技术有限公司），T25培养瓶（NEST），0.1%胶原酶I（Sigma，USA），0.25%胰酶（Sigma，USA），地塞米松 0.1μmol／L、β－甘油磷酸钠盐10mmol／L、抗坏血酸磷酸盐50μmol／L T75培养瓶（NEST），150mm 培养皿（NEST），二氧化碳培养箱（上海力申科学仪器有限公司），低温离心机（上海菲恰尔分析仪器有限公司），超净工作台（苏州洁诺净化科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 UC－MSC的原代培养 健康足月胎儿脐带经产妇同意后，根据伦理委员会通过的指导原则采集，将脐带用75%酒精冲洗，然后剔除动脉和静脉，剪碎，成糊状。用0.1%胶原酶I、双抗，37℃消化24小时，再加入0.25%胰酶和盐水，37℃消化1小时，然后加入盐水混匀，离心，沉淀用α－MEM培养液接种于T25培养瓶中，标记为P0。把培养瓶置于37℃，5%CO2培养箱中培养。用倒置显微镜观察细胞的生长情况，4－6天后换液，弃去非贴壁细胞后，每3天换液一次。

1.2.2 UC－MSC的传代和纯化 原代培养的细胞增殖在瓶底融合基本达到90%时，用0.25%胰酶和盐水按1∶1混合，消化细胞，用培养液终止消化反应，再用移液管轻轻吹打，使细胞脱壁，然后放入离心管中，1 300r／min，离心5min，弃去上清，收集细胞，加入新的培养液，混匀后传代。传于T75培养瓶中继续培养，标记为P1。用倒置显微镜观察细胞生长情况，每3天换液一次，至贴壁细胞融合达到90%时，消化传代，按1∶3传代于150mm培养皿中。之后重复上面操作，反复传代到P6代。

1.2.3 细胞生长曲线的测定 取生长状态良好的第3代细胞，消化后，按1×104个细胞／孔接种于24孔板，每隔24小时消化3个孔，收集细胞。用胎盼兰染色，计数活细胞，绘制生长曲线。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞 将对数生长期培养细胞接种于24孔细胞培养板（1.0×104细胞／孔），非诱导组继续用完全培养基培养，诱导组培养液中加入标准诱导剂（地塞米松0.1μmol／L、β－甘油磷酸钠盐10mmol／L、抗坏血酸磷酸盐50μmol／L）进行成骨分化诱导，每3天全量换液，第14天应用碱性磷酸酶组化染色试剂盒进行碱性磷酸酶（ALP）染色、应用4－NPP法检测ALP活性，第21天Von kossa染色。取生长状态良好的第3代细胞进行检测，将贴壁细胞常规消化，PE标记CD44，CD73，CD31，CD45，流式细胞仪检测。

2 结果

2.1 脐带间充质细胞的形态

倒置显微镜下观察，接种后的UC－MSC呈小圆颗粒，1－3天后开始贴壁，7－10天后，可见贴壁细胞呈纺锤形，多角形，梭形。2周后，增长速度较快，2－3周后可形成片状融合达到80%－90%，呈现平行排列生长或旋涡状生长，可以传代。传代细胞较原代细胞生长快，连续传6代，细胞形态无明显变化。见图1。

图1 UC－MSC细胞形态

2.2 生长曲线

传代后各代细胞生长曲线均呈S型，第1－2天细胞处于潜伏期，无明显增殖，一般第3天开始增长，第10－12天可达到80%以上融合，然后进入平台期，见图2。

图2 UC－MSC生长曲线

2.3 流式细胞仪检测UC－MSC表面标志

取第3代脐带间充质干细胞，用流式细胞仪检测，CD31阳性率0.1%，CD45阳性率0.2%，CD44阳性率93.5%，CD73阳性率40.0%。见图3。

2.4 成骨与成脂定向诱导分化与鉴定

成骨分化定向诱导培养后1周，部分细胞基质出现结节样钙沉积。培养2周之后，按碱性磷酸酶检测试剂盒操作步骤进行碱性磷酸酶染色。染色后，碱性磷酸酶在胞浆内显示为蓝色颗粒状物，对照组细胞未加诱导剂，碱性磷酸酶染色呈阴性。成脂分化定向诱导培养后1周时，少数细胞内就出现微小明亮的脂滴。随着诱导时间的延长，出现脂滴的细胞增多，细胞由梭形变成椭圆形或角形。培养2周后，脂滴数目增多、融合。油红0染色后镜下观察，细胞内脂滴呈明亮橙红色，非诱导组呈阴性。见图4。

图3 流式细胞仪检测UC－MSC

图4 成骨与成脂定向诱导分化和鉴定

在成骨分化诱导培养3周后，进行Von kossa染色，发现诱导组出现黑色的矿化结节，非诱导组细胞Von kossa染色呈阴性（200×）。见图5。

3 讨论

图5 Von Kossa染色

间充质干细胞呈纤维状，是多能干细胞中的一种［2］。它具有高度自我更新能力和多向分化潜能，能在特定条件下分化为神经细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等，已应用于临床治疗急性移植物抗宿主病、缺血性心脏病、缺血性脑病等，安全有效［3］。MSCs在骨髓组织中含量最为丰富，但骨髓取材困难，供者难以接受，来源受到限制，而且随着年龄的老化，骨髓源MSCs细胞数量及增殖分化潜能显著下降，并且存在病毒感染的潜在危险。本实验采用细胞贴壁法分离、培养UC－MSC，细胞形态以梭形类纤维样为主，传代后细胞生长较快，流式细胞仪检测第三代UC－MSC表面抗原，CD31和CD45几乎无表达，CD44阳性率93.5%，CD73阳性率40.0%，成骨与成脂定向诱导分化，鉴定阳性，说明本实验方法可得到纯度较高的间充质干细胞［4］。

UC－MSC目前已可稳定地在体外分离，并且扩增迅速，已无来源及数量上的限制，而低免疫原性、支持造血及多向分化潜能的特点使其有着广泛的应用前景，在细胞替代治疗及组织工程方面有极大的应用价值，为神经系统疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病、糖尿病等的治疗带来了新的希望。

［1］Plttenger MF，Mackay AM，Beck SC，et al.Multilineage potential of adult human mesenchvmal stem cells［J］.Science，1999，284（5411）：143.

［2］Jiang Y，Jahagirdar BN，Reinhardt RL，et al.Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow ［J］.Nature，2002，418 ：41.

［3］Lee JS，Hong JM，Moon GJ，et al.A long－term follow－up study of intravenous autologous mesenchymal stem cell transplantation in patients with ischemic stroke［J］.Stem cells，2010，28：1099.

［4］Deans RJ，Mlseley AB.Mesenchymal stem cells：biology and potential clinical uses［J］.Exp Hematol，2000，28（8）：875.