维生素E对心肌氧化损伤的保护作用研究

陈 昕，赵 雷，韩蕴琪，孙 波，石 毅，周余来

（1.暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院 检验科，广东 深圳518020；2.吉林大学药学院 生物工程教研室，吉林 长春130021）

在人体的许多生理过程之中都有自由基的参与。心肌细胞是一种对自由基毒性敏感的组织，因为它含有丰富的酶和膜组织，二者都易被自由基所破坏。在多种心肌细胞损伤的情况下，均发现心肌细胞内有过量的自由基的产生［1，2］。因此，能够清除自由基，减轻过氧化损伤的药物即可对心肌细胞产生保护作用。维生素E能清除体内的自由基，是一种常用的抗氧化药物［3］。本实验旨在验证维生素E对阿霉素产生的心肌细胞过氧化损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂

实验使用新生 Wistar大鼠，清洁级，由吉林大学基础医学院实验动物中心提供（动物饲养合格证号：NO：0010281）；新生小牛血清由Gibco公司提供；MEM培养基由Gibco公司提供；胰蛋白酶由HYCLONE公司提供；盐酸阿霉素为浙江海正药业股份有限公司产品；山莨菪碱为天津药业集团新郑股份有限公司产品；乳酸脱氢酶（LDHI）测定试剂盒、一氧化氮合成酶（NOS）测定试剂盒、丙二醛（MDA）测定试剂盒为南京建成生物有限公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 乳鼠心肌原代培养 取新生Wistar大鼠心肌细胞培养于MEM培养液中，加入10%灭活胎牛血清，细胞浓度1×105／ml，每孔200μl接种至96孔板中，37℃，5%CO2培养箱内培养。24h后，观察细胞，当心肌细胞贴壁后，换液。在培养48h后，可见心肌细胞连接成片，并产生有节律的自主跳动。

1.2.2 实验分组及造模给药方法 约48h之后，将培养细胞分组给药。空白对照组加MEM培养液培养；模型组加阿霉素浓度为2μg／ml的 MEM培养液培养；药物保护组分设3种浓度梯度分别加150μg／ml维生素E＋2μg／ml阿霉素、300μg／ml维生素E＋2μg／ml阿霉素和600μg／ml维生素E＋2μg／ml阿霉素。

1.3 检测指标

1.3.1 细胞形态学观察 心肌细胞培养24h后，在倒置相差显微镜下观察细胞的形态，细胞的生长状态以及细胞的搏动率。

1.3.2 细胞损伤生化指标测定 在心肌细胞给药培养48h后，按试剂盒说明书检测培养液上清LDH和NOS含量；检测培养心肌细胞超声破碎得到细胞混悬液检测MDA的含量。

1.4 统计学处理

所有数据以±s表示，数据用统计学软件SPSS V13.0进行处理。多组间的比较用单因素方差分析，P＜0.05为有显著性差异，P＜0.01为有非常显著性差异。

2 结果

2.1 心肌细胞的形态学影响

在细胞贴壁24h后，即可见心肌细胞已连结成片，有自主有规则的搏动。在给药之后，分别观察空白对照组、损伤组和药物修复组，发现组间已具有明显的形态差异：.空白对照组（见图1）：心肌细胞成多边形生长状态良好，细胞边缘清晰，相互通过伪足连接成片，细胞间有相互偶联的自主搏动，搏动稳定；模型组（见图2）：模型组形态改变明显，细胞皱缩，细胞的边缘不清晰，自主节律跳动消失，细胞间的连接被破坏，偶见漂浮的细胞；修复组心肌细胞（见图3）：多数细胞边缘清晰，仍有自主搏动，但部分细胞可见边缘模糊，自主搏动消失等破坏现象。

图1 空白对照组的心肌细胞（×100）

图2 阿霉素组的心肌细胞（×100）

图3 维生素E修复组的心肌细胞（×100）

2.2 维生素E对阿霉素造成的心肌细胞损伤的保护作用

各组细胞给药后培养达48h时，阿霉素损伤组心肌细胞培养基中LDH、NOS和MDA含量明显增加，与正常组比较差异非常显著（P＜0.01）；药物保护组的LDH、NOS和MDA含量较阿霉素损伤组降低，差异明显（P＜0.01或P＜0.05）且降低呈现剂量依赖性。见表1。

表1 维生素E对阿霉素引起的心肌细胞损伤的作用

3 讨论

自由基是一种机体代谢的中间产物，是能独立存在的含有一个或一个以上的不配对电子的原子或原子团。它有很强的氧化反应能力，可以产生连锁反应损伤机体。它所造成的损伤主要有破坏核酸结构发生基因突变；使不饱和脂肪酸产生脂质过氧化；使蛋白质和糖类等大分子发生交联。伴随着这些生物大分子结构的破坏，细胞的代谢活动会受到较大的影响，如阻碍呼吸作用中的电子链传递，引起细胞凋亡，破坏离子转运，改变细胞内液成分等等。

阿霉素是临床上广泛应用的抗癌药物，由于其特定的结构，在进入心肌细胞后分别在微粒体和线粒体中产生O2、OH、H2O2等氧自由基，作用于心肌细胞膜及各种细胞器膜上磷脂中的多价不饱和脂肪酸，形成脂质自由基，引发脂质过氧化反应，使膜的结构发生改变，并影响膜上功能蛋白质的位置及构型，最终导致膜的完整性遭到破坏，膜的流动性降低，通透性增加，容量调节功能及离子转运功能障碍［4］。另外，阿霉素使心肌细胞主要的抗氧自由基酶活性降低，而不能有效地保护心肌细胞免受氧自由基的损伤。因此心脏毒性是阿霉素最为主要的副作用之一，这严重制约了它在临床的应用。可见寻找有效的抑制阿霉素心脏毒性的药物在临床具有重要的意义。

维生素E是细胞内存在的高效自由基清除剂和脂质过氧化作用的阻断剂。研究证明，它能够有效的保护心血管系统减少心血管病的发病率［5，6］，对克山病、缺血再灌注损伤均有疗效［7］。在本实验以心肌细胞作为研究对象，体外以阿霉素诱导损伤构建细胞病理模型，从细胞形态学、乳酸脱氢酶含量、一氧化氮合成酶含量、丙二醛含量等方面观察了维生素E对ADM中毒心肌细胞的保护。

由于过氧化损伤可造成心肌细胞的脂膜损伤，导致心肌细胞线粒体内富含的氧化酶类外漏，因此心肌细胞培养液之中的LDH作为衡量心肌细胞生长状态的有效指标，可反映心肌细胞细胞膜因脂质过氧化作用而受损的情况。模型组的LDH含量明显增高，说明心肌细胞的线粒体膜在受损之后已发生崩解导致LDH外漏。而药物保护组（维生素E）LDH浓度明显减低，说明维生素E可以减轻线粒体膜的崩解程度，对阿霉素造成的心肌氧化损伤有保护作用。

NOS是另一种衡量心肌细胞代谢状态的有效指标，可由阿霉素诱导产生。有研究发现，一氧化氮合酶（NOS）可使细胞产生NO增加，与阿霉素致心肌细胞产生增加的O2－反应生成过氧亚硝基阴离子（ONOO－）。ONOO－是一种强氧化剂，可迅速分解为高活性的OH－和NO等自由基，参与脂质过氧化。本实验中，损伤模型组的NOS含量高于空白对照组，说明损伤模型组心肌细胞受阿霉素氧化损伤后被诱导产生较多NOS。而在药物保护保护组，该指标明显较低，表示维生素E能够有效的抑制NOS的诱导产生，从而防止产生高活性的OH－和NO等自由基，抑制脂质过氧化，有效的保护了心肌细胞。

质膜上的脂肪酸会在自由基的作用之下产生丙二醛（MDA）等产物，且丙二醛的含量和受损程度相关，因此MDA含量能间接的反映细胞受损的程度。模型组的MDA含量要比空白对照组明显增高，说明模型组细胞经脂质过氧化损伤之后产生MDA。药物保护组的MDA含量较模型组明显下降，说明维生素E作为生物体内常见的还原剂，可以有效的阻碍自由基对不饱和脂肪酸的进攻，从而减少MDA的产生。

本研究显示维生素E分别从线粒体膜的崩解、自由基诱导生成、不饱和脂肪酸被氧化的三个方面发挥作用，有效地减轻ADM引起的心肌细胞损伤、保存细胞活力、维持相对规律的心肌搏动，对心肌细胞有保护作用。因此维生素E在减轻阿霉素等蒽环类药物的心脏毒性作用，提高化疗期癌症病人的生存质量上有较大的应用价值。

［1］童荣生.自由基与心血管疾病［J］.现代临床医学，2007，33（2）：189.

［2］Wim－Jan P.van Boven，Win B.Gerrisen，Antoine H.Driessen.Myocardial oxidative stress，and cell injury comparing three different techniques for coronary artery bypass graft［J］.European Journal of Cardio－Thoracic Surgery，2008，34（5）：969.

［3］M.Dietrich，P.F.Jacques，M.J.Pencina.Vitamin E supplement use and the incidence of cardiovascular disease and all－cause mortality in the Framingham Heart Study：Does the underlying health status play a role［J］.Atherosclerosis，2008，36（6）：864.

［4］陈立娟，郭家彬，彭双清，等.阿霉素致大鼠心脏氧化损伤及其机制的研究［J］.毒理学杂志，2006，20，（3）147.

［5］王 璇，高玉霞，常 红.维生素C、E对血管内皮细胞氧化损伤保护作用［J］.中国公共卫生2009，25（2）：193.

［6］汪求真.维生素E对氧化应激及相关慢性病的影响［J］.国外医学卫生学分册，2008，35（6）：364.

［7］郭 健，刘 义，李岩平.氧自由基与心肌缺血在灌注损伤［J］.中国心血管杂志，2008，13（5）：385.