慢性乙型肝炎病毒感染者乙肝病毒大蛋白检测的临床意义

王建华，王卫国，马黎丽，王 伟，化术静，张红安

（阜阳市人民医院 检验科，安徽 阜阳236004）

乙型肝炎病毒（HBV）是世界上危害公众健康的最大的感染性因子之一，而我国是乙型肝炎的高发区，人群中乙型肝炎病毒的携带率约10.3%左右，慢性乙型肝炎患者约3000万人［1］。目前临床对HBV感染患者，通常使用血清学指标（乙肝二对半）、HBV－DNA和肝功能检测，来反映患者病毒是否复制及抗病毒治疗疗效观察。由于e抗原敏感性较差以及HBV－DNA检测要求较高，临床需要一种操作简单易行并且较为敏感的指标来反映病毒复制。HBV－LP是一种包含PreS1、PreS2和HBsAg的病毒包膜蛋白，具有复杂的跨膜构象拓扑结构，参与HBV的吸附、包膜化、组装、成熟等过程，并与肝细胞纤维化、肝癌及丁型肝炎的发生有关［2－5］。本实验通过检测慢性HBV感染者HBV－LP、PreS1Ag、PreS2Ag、HBV－DNA 及肝功能，探讨 HBV－LP的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择收集2009年10月至2011年2月于阜阳市人民医院就诊的180例慢性HBV感染者，诊断标准符合第十次全国传染病与寄生虫病学会和肝病学分会联合修订的病毒性肝炎防治方案，其中 HBV－DNA阳性患者130例，其中男84例，女46例，年龄9～77岁，HBV阴性患者50例，其中男26例，女24例，年龄15～64岁。所有选择对象留取血清2ml，－80℃冻存备用。

1.2 主要试剂及仪器 乙肝两对半试剂（上海科华生物工程有限公司），HBV－LP、PreS1、PreS2试剂盒（北京热景生物技术有限公司），HBV－DNA检测试剂盒（广州中山达安基因有限公司），肝功能检测试剂盒和相应标准品及质控品（中生北控生物科技股份有限公司），酶标仪，日立7600生化分析仪等。

1.3 实验方法 按试剂盒说明书要求ELISA方法检测二对半、HBV－LP、PreS1、PreS2，按要求设定cut－off值，读取各孔OD值。HBV－DNA检测按照说明书要求进行。肝功能检测按照要求设置测试协议，于生化分析仪检测。

1.4 统计学方法 采用t或t’检验和卡方检验。

2 结果

2.1 HBV－LP表达与 HBV－DNA拷贝数的关系180例 HBV感染者，血清 HBV－LP与 HBV－DNA的阳性符合率为94.6%（123／130），阴性符合率为66.0%（33／50），总符合率为86.7%，HBV－LP阳性率（77.8%）与 HBV－DNA 阳性率（72.2%）差异无统计学意义（P＞0.05）。通过分析 HBV－LP各孔吸光度值（OD值）与HBV－DNA拷贝数（取log值）关系，HBV－LP表达与HBV－DNA拷贝数呈正相关（r＝0.53，P＜0.05）

2.2 二对半模式中HBV－LP和HBV－DNA检测结果 检出HBsAg、HBeAg、HBcAb阳性（1，3，5阳性模式）125例，HBV－LP阳性率92.0%（115／125），HBV－DNA阳性率91.9%（75／80），两者阳性率比较无统计学意义（P＞0.05）。检出HBsAg、HBeAb、HBcAb阳性52例（1，4，5阳性模式），HBV－LP阳性率51.9%（27／52），HBV－DNA阳性率42.3%（22／52），两者阳性率比较无统计学意义（P＞0.05）。其他二对半模式数量较少，暂不统计。

2.3 HBV－LP与Pres1、Pres2表达的关系 180例样本HBV－LP、PreS1、PreS2阳性率分别为77.8%、58.9%、96.1%，HBV－LP阳性率明显高于 PreS1（P＜0.01），HBV－LP阳性率低于PreS2（P＜0.01）。

2.4 HBV－LP表达与肝功能指标间的关系 HBV阳性患者的ALT（谷丙转氨酶）、AST（谷草转氨酶）水平高于 HBV－LP阴性患者（P均＜0.05），T－BIL（总胆红素）、TP（总蛋白）、Alb（白蛋白）水平差别无统计学意义（见表1）。

表1 HBV－LP表达与肝功能的结果

3 讨论

HBV感染在我国属于危害较重的传染性疾病，目前临床判断患者病毒是否复制，常用指标是HBeAg和HBV－DNA。临床发现一部分HBeAg阴性患者，但病毒依然大量复制，而HBV－DNA检测条件要求高，质量控制严格，使其检测难以广泛普及。一般抗病毒治疗终点选择是HBeAg和HBVDNA转阴，但这部分转阴的患者病情常出现反复。当前需要一种新的指标来反映HBV的复制状况。HBV的S基因编码3种外膜蛋白：主蛋白（HB－sAg）、中蛋白（HBsAg和Pre－s2蛋白）、大蛋白（HB－sAg、Pre－s1蛋白和 Pre－s2蛋白，HBV－LP），研究证明HBV－LP在病毒复制过程中起着关键作用，可作为受体蛋白与细胞受体结合介导病毒粒子的细胞内摄入，并参与病毒粒子的组装和分泌，还可以反式激活细胞内病毒的复制等［3，4，6］。

本实验发现HBV－LP与HBV－DNA有明显相关性，提示HBV－LP的表达与病毒的复制有关，这为临床判断病毒病毒复制与否，提供新的实验室指标。我们也发现7例样本HBV－DNA阳性而HBVLP阴性，可能与PCR技术的高灵敏度有关［7］，同时有17例样本HBV－DNA阴性而HBV－LP阳性，因为HBV感染者血清中有3种颗粒：小球型颗粒、管型颗粒、Dane颗粒，其中管型颗粒和Dane颗粒表面有HBV－LP，这部分患者可能血清中含有管型颗粒而无Dane颗粒，而且HBV－LP在外周血消失需要一定的半衰期，有研究发现抗病毒治疗后，HBV－LP的消失比HBV－DNA晚［8］，也有可能虽然血清中检测不出HBV－DNA，但肝细胞内病毒仍在复制，由于病毒复制时，需要 HBV－LP的合成，使得 HBV－LP较早释放入血。当前，用于抗HBV的胞苷类药物主要抑制DNA聚合酶活性，以肝功能改善和HBVDNA转阴来选择治疗终点，但一部分患者虽然HBV－DNA转阴，但很快病情出现反弹，这可能与HBV－LP继续表达，反式激活病毒复制有关。Gripon等研究发现［9］，源于大蛋白的乙酰化肽段能够使肝细胞表面的受体失活，切断病毒感染其他肝细胞的途径，这为抗病毒靶点及治疗终点的选择提供新的可能，也提示HBV－LP检测或许可以检测抗病毒疗效，但这需要更加全面深入的研究。

本实验分析两种常见二对半模式HBV患者发现，HBV－LP和 HBV－DNA阳性率无统计学差异，HBeAg阳性患者，HBV－LP和 HBV－DNA阳性率均较高，提示病毒正在复制，但是HBeAg阴性患者，HBV－LP和HBV－DNA都有一定的阳性率。由于迫于机体免疫压力和药物压力等，造成HBV基因组的前C区和核心启动子变异，HBeAg转阴，但病毒仍然在复制，以上实验说明HBV－LP比HBeAg反映病毒复制更加确切和灵敏。同时比较HBV－LP和PreS1、PreS2表达发现，HBV－LP阳性率明显高于PreS1，而低于PreS2表达。根据HBV外膜蛋白的结构，只有HBV－LP中包括PreS1，造成这种检测率的差异，主要与选择单克隆抗体有关，检测PreS1的抗体是针对其线性表位，PreS1抗原的表位在形成空间构象时，只有一部分关键氨基酸序列暴露在外［4］，由此造成PreS1检出率偏低，而HBV－LP检测采用的是立体构象表位。本实验PreS2蛋白检出率均较高，一般情况下，HBV感染者不会只有小蛋白表达，而且一旦发生PreS2表达缺失，会引起肝细胞严重损失，虽然PreS2表达与病毒的复制有关，但本实验检测结果显示其检测缺少一定的特异性，从而限制其在临床的应用。通过对所选样本的肝功能分析发现，HBV－LP阳性患者的ALT、AST水平高于HBV－LP阴性患者，由于ALT及AST是反映肝细胞损伤极为灵敏的指标，提示HBV－LP的表达与肝细胞损伤有关，而其T－BIL（反映肝细胞处理毒素的能力）、TP和Alb（一定程度反映肝细胞合成功能）的差别无统计学意义，主要与肝细胞有强大的代偿能力有关。

总之，HBV－LP的表达是病毒复制的指标之一，由于其检测简单、快速，在基层医院有着较好应用前景，是血清学检测指标的有益补充。

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