山西育成小麦品种Wxay蛋白缺失体的筛选与鉴定

王曙光 孙黛珍 王慧慧 曹亚萍 贾寿山 史雨刚 彭锁堂

山西育成小麦品种Wxay蛋白缺失体的筛选与鉴定

王曙光1孙黛珍1王慧慧1曹亚萍2贾寿山1史雨刚1彭锁堂1

(山西农业大学农学院1，太谷 030801)
(山西省农业科学院小麦研究所2，临汾 041000)

Wx蛋白即颗粒结合型淀粉合酶，由Wx－A1、Wx－B1和Wx－D1三个亚基组成，其中任意一个亚基的缺失都影响着小麦籽粒中直链淀粉的含量，为了解山西育成小麦品种Wx蛋白缺失类型，用SDSPAGE和分子标记技术分别在蛋白质和DNA水平上对175份山西育成的小麦品种资源进行了分析，共检测到1份Wx－A1亚基缺失材料临优2018，6份Wx－B1亚基缺失材料——临汾98－1017、晋麦54、晋农76、长6154、太麦703和太麦8003，没有发现缺失Wx－D1亚基、同时缺失两个亚基和三个亚基全缺失的材料。

小麦 Wxay蛋白 SDS－PAGE 分子标记

在普通小麦直链淀粉合成过程中起主要作用的颗粒结合淀粉合成酶(GBSSⅠ)也称Waxy蛋白［1］。Waxy蛋白由Wx－A1、Wx－B1和Wx－D1三个亚基组成，其编码基因分别位于7AS、4AL和7DS上［2－3］。Waxy蛋白亚基缺失会使胚乳中直链淀粉合成减少，支链淀粉含量上升，当三个亚基全部缺失时，小麦籽粒胚乳中直链淀粉含量接近于0或很少(＜1%)，这种小麦称为糯小麦［3］。普通小麦的Waxy亚基组成理论上分为8种类型，自然界中存在5种:正常、缺失Wx－A1、缺失Wx－B1、缺失Wx－D1、缺失Wx－A1和Wx－B1［4］。除野生型外，Wx－B1缺失型最常见。不同Waxy蛋白缺失类型的小麦品种，其小麦粉的直链淀粉含量不同，在一定程度上影响面条、面包等以小麦粉为原料的食品品质，以缺失Wx－B1亚基对直链淀粉含量的影响最明显［5－6］。因此研究小麦Waxy蛋白的遗传变异对于选育适合不同加工目的的小麦品种具有重要意义。

山西省南北狭长，横跨暖温带和中温带两个气候带，在全国生态区划中，又分别属于黄淮冬麦区、北方冬麦区和北方春麦区，加之海拔高度差异大，地形复杂，形成各地差异悬殊的自然条件和复杂多样的气候生态类型，各地小麦品质存在明显差异，形成不同的品质生态类型，因此有必要对其Waxy蛋白的组成进行分析鉴定。本研究以175份山西育成的小麦品种(系)为材料，利用SDS－PAGE和分子标记技术筛选鉴定其Waxy蛋白的缺失体，以期为今后小麦品质育种提供基础材料。

1 材料与方法

1．1 试验材料

选用175份山西育成的小麦品种(系)，其中中部晚熟冬麦区73份，南部中熟冬麦区102份(表1)，以中国春(CS)为对照。所有供试材料于2009年10月种植于山西农业大学农作站试验田，每个品种2行，行长2 m，行距25 cm。田间管理同大田，灌浆期注意去杂，2010年6月收获。

1．2 试验方法

1．2．1 Waxy蛋白的提取和SDS－PAGE电泳

Waxy蛋白的提取参照王子宁等［7］的方法，SDS－PAGE电泳参考Zhao等［8］和王子宁等［7］的方法。

1．2．2 Waxy基因位点的检测

总DNA的提取采用Devos等［9］改进的酚－氯仿法。

引物1用于检测Wx－7A和Wx－7D的SSR标记，由Shariflou［10］开发，目标扩增片段是包括3'末端附近(AT)n重复序列在内的265和204 bp的序列。

上游引物:5'—CGCTCCCTGAAGAGAGAAAGAA—3'

下游引物:5'—ATAGGCACAACCCCTAAC—3'

PCR扩增体系为20μL，扩增反应在Eppendorf Thermocycler上进行，反应条件为:首先95℃变性3 min;然后94℃变性1 min，58℃退火50 s，72℃延伸50 s，38个循环;最后72℃延伸10 min。扩增产物在6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离。

引物2用于检测Wx－4A基因位点的STS引物，由Briney［11］开发，目标扩增片段包括第4内含子在内的一段440 bp序列。

上游引物:5'—AACCAGCAGCGCTTCAGCCT—3'

下游引物:5'—TTGAGCTGCGCGAAGTCGTC—3'

PCR扩增体系为20μL，扩增反应在Eppendorf Thermocycler上进行，反应条件为:首先94℃变性3 min;然后94℃变性15 s，64℃退火2 min，72℃延伸2 min，35个循环;最后72℃延伸10 min。扩增产物中加10μL的变性缓冲液，95℃变性5 min。扩增产物在6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离。

2 结果与分析

2．1 山西育成小麦品种Waxy蛋白的SDS－PAGE鉴定

对175份山西育成小麦品种Waxy蛋白进行SDS－PAGE检测，共有7份Wx蛋白亚基缺失的材料，包括1份Wx－A1缺失的材料和6份Wx－B1缺失的材料(表1)。Wx－A1缺失的是临优2018(图1)，Wx－B1缺失的是晋麦54、临汾98－1017、长6154、晋农76、太麦703和太麦8003。没有发现Wx－D1缺失、两个亚基同时缺失和三个亚基全缺失的品种(即全糯性品种)。

表1 175份小麦品种Wxay 蛋白筛选鉴定结果

续表

续表

图1 山西小麦品种Waxy蛋白的SDS－PAGE电泳图

2．2 Wx－A1和Wx－D1亚基的SSR分子标记鉴定

小麦Wx基因cDNA序列的近3'端有不完整的(AT)6A(AG)2，大麦Waxy基因在相似位点也有类似的(AT)4重复序列，Sharriflou等［10］据此设计了一对引物，用这一引物进行PCR扩增，结果得到两条带，一条是204 bp的特异条带，另一条约265 bp，中国春N7A－T7D(Wx－A1亚基缺失)缺失了265 bp的特异条带，N7D－T7A(Wx－D1亚基缺失)缺失了204 bp的特异带。所以这一引物可以作为Wx－A1和Wx－D1亚基的特异分子标记。

用这一标记鉴定175份山西小麦品种资源的Waxy蛋白的Wx－A1和Wx－D1亚基是否缺失，发现图2中第18泳道的临优2018缺失265 bp的目标条带，证明其缺失Wx－A1亚基，其余品种都扩增到两条目标带，证明Wx－A1和Wx－D1没有缺失，与SDS－PAGE结果一样。

2．3 Wx－B1亚基的STS分子标记鉴定

Briney等［11］设计的STS－PCR引物序列，从野生型普通小麦的Wx－B1位点可扩增出440 bp左右的产物，而在突变型中由于基因的大片段缺失则无此产物，所以这一标记可以用来鉴定Wx－B1亚基是否缺失。用这一标记检测175份供试材料，发现晋麦54、临汾98－1017、晋农76、长6154、太麦703和太麦8003未扩增出440 bp的目标带，表明缺失Wx－B1亚基(图3)，而其余品种都扩增出440 bp的目标带，印证了SDS－PAGE检测结果。

图3 部分品种Wx－7B基因的分子标记检测

图2 部分品种Wx－7A、Wx－7D基因的分子标记检测

2．4 山西育成小麦品种Waxy蛋白缺失体的分布

SDS－PAGE与分子标记鉴定表明所有供试材料以Wx－B1缺失型居多，共6份，占材料总数的3．4%;其中中部晚熟冬麦区有4份，占其总数的4．1%;南部中熟冬麦区2份，占其总数的1．9%。缺失Wx－A1的材料1份，占材料总数的0．59%，占南部中熟冬麦区的0．98%(表2)。

表2 供试品种Waxy蛋白亚基分析

3 讨论

Waxy蛋白是小麦直链淀粉合成过程中的一种关键酶，与小麦粉品质关系密切。研究小麦Waxy蛋白的亚基组成，筛选突变体，为培育适合不同加工品质的小麦品种提供亲本材料，对改善小麦品质具有重要意义。Yamamori等［2］研究了日本等11个国家的1960份小麦材料，发现朝鲜、日本和土耳其的小麦中主要是Wx－A1亚基缺失型，澳大利亚和印度的小麦品种主要是Wx－B1亚基缺失型。中国的小麦品种中Waxy蛋白亚基突变的比例不高，主要的突变体是Wx－B1缺失型，且发现了世界上仅有的Wx－D1缺失型小麦品种白火麦［12］。王海萍［13］对山西省、河南省、河北省等九个省市的冬播小麦品种进行分析，结果证明各省市小麦品种Waxy蛋白亚基缺失频率差异较大，山西省缺失频率为3．72%。徐兆华等［14］对国内冬播麦区294份小麦品种(系)筛选结果表明各个麦区之间Waxy蛋白亚基缺失频率差异较大，北部冬麦区、黄淮冬麦区和长江中下游春麦区的频率较低，西南冬麦区的频率较高。本试验检测了175份山西冬小麦材料，Wx－B1缺失频率较高，与前人研究结果相似［12－13］。

分子标记在研究遗传多样性和理解各种性状的遗传控制方面具有重要作用，其在作物育种和选择工作的辅助作用越来越受重视，世界各国都在积极筛选简便、实用和可靠的分子标记，同时十分注重对已有标记的验证。基于小麦Waxy基因的cDNA序列，目前已有多个Waxy蛋白的分子标记［12，15－16］。本试验选用的两个分子标记分别是由Shariflou等［10］开发的一个Wx－A1和Wx－D1基因的SSR标记以及Briney等［11］开发的一个Wx－B1基因STS标记，王海萍［14］用中国春的相应缺体四体对这两个标记进行检验，证实其辅助选择Waxy蛋白缺失体的有效性。本研究在SDS－PAGE鉴定的基础上，利用这两对引物对所有供试材料进行了鉴定筛选，提高了试验结果的可靠性。

4 结论

4．1 用SDS－PAGE和分子标记检测到1份Wx－A1亚基缺失材料临优2018，6份Wx－B1亚基缺失材料——临汾98－1017、晋麦54、晋农76、长6154、太麦703和太麦8003，没有发现缺失Wx－D1亚基、同时缺失两个亚基和三个亚基全缺失的材料。

4．2 用Wx－A1和Wx－D1基因的SSR标记进行扩增后，正常材料得到204 bp和265 bp两条带，蛋白检测存在Wx－A1和Wx－D1亚基;蛋白检测缺失Wx－A1亚基的材料只扩增出204 bp的条带，缺失265 bp的条带。用Wx－B1基因的STS标记进行扩增，缺失440 bp条带的材料，蛋白检测缺失Wx－B1亚基。证明这两个标记可以用于Wxay基因的辅助选择。

志谢:山西省现代农业产业技术体系小麦产业专项资助。

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Screening and Identification of Wxay Protein Mutants of Wheat Varieties Bred in Shanxi

Wang Shuguang1Sun Daizhen1Wang Huihui1Cao Yaping2Jia Shoushan1Shi Yugang1Peng Suotang1
(College of Agriculture，Shanxi Agricultural University1，Taigu 030801)
(Wheat Research Institute，Shanxi Academy of Agriculture Sciences2，Linfen 041000)

Wx protein，granule－bound starch synthase，is composed of Wx－A1、Wx－B1 and Wx－D1subunits，deficiency of which will make starch content of wheat grains decrease．In order to discover more Wxay protein deficiency mutants，175 wheat varieties bred in Shanxi were identified at the nucleotide and protein levels using SDS－PAGE and molecular markers．The result indicated that 1 variety，Linyou2018 were the null of Wx－A1 types，6，Linfen98－1017，Jinmai54，Jinnong76，Chang6154，Taimai703，Taimai8003 were the null of Wx－B1 types，the null of Wx－D1 and the null of any 2 or 3 subunits were not detected．

wheat，waxy protein，SDS－PAGE，molecular marker

S512．1;S336

A

1003－0174(2012)07－0006－06

山西省科技攻关项目(2007031001－6、20100312001)，山西省回国留学人员择优资助项目(2008)，山西省留学基金(2010048)

2011－08－08

王曙光，男，1962年出生，硕士，小麦遗传育种

孙黛珍，女，1964年出生，博士，教授，小麦遗传育种