山药多糖的体外抗氧化活性及对正常小鼠的免疫增强作用

许效群 刘志芳 霍乃蕊 赵 媛 田 夏 雷婷婷

山药多糖的体外抗氧化活性及对正常小鼠的免疫增强作用

许效群1刘志芳2霍乃蕊1赵 媛1田 夏1雷婷婷1

(山西农业大学食品科学与工程学院1，太谷 030801)
(山西农业大学附属医院2，太谷 030801)

从提取淀粉后的山药汁液干粉中提取多糖，探讨其体外抗氧化活性和对正常小鼠的免疫调节活性。结果表明山药多糖的还原力随着浓度的提高显著增强，对DPPH·、·OH及O2·-具有较强的清除能力，并呈一定的剂量关系，清除率分别可达到92．73%、84．72%、89．14%;与正常对照组小鼠相比，中、高剂量组的免疫脏器指数和吞噬细胞的吞噬指数、血清溶血素水平均显著提高，其中高剂量组均达到极显著水平，高剂量组还极显著增加迟发型变态反应引起的小鼠足跖厚度。因此山药多糖具有较好的抗氧化性和免疫增强活性，为安全天然食品抗氧化剂、免疫增强剂的开发提供了新来源，并为山药的综合开发利用奠定了基础。

山药多糖 抗氧化 免疫增强

山药(Dioscorea opposite Thunb)为薯蓣科多年生宿根蔓生植物薯蓣的块茎，是我国传统的药食同源食物之一［1］。山药中的淀粉占其干物质的60%～70%，另外含有多糖、黏液蛋白、皂苷、尿囊素和纤维素等多种功能活性成分［2－3］。多糖是山药的主要活性成分，占其干物质的2．15%～2．92%［4］。以往好多研究均从山药中直接提取多糖，而将淀粉及其他成分作为残渣废弃，虽然多糖提取率较高，但淀粉由于糊化变性而大大失去利用价值。课题组从山药的工业化综合利用出发，先提取淀粉，然后将淀粉提取过程中分离的山药汁液和纤维残渣分别收集并干燥成粉，再进一步从中提取山药粗多糖和其他功能性成分。本研究将研究经从山药汁液干粉中所提取的多糖的抗氧化及免疫调节活性，为山药汁液干粉的应用、天然安全食品抗氧化剂、免疫增强剂的开发研制及山药的工业化综合加工提供科学依据。

1 材料与方法

1．1 原料、试剂与设备

山药汁液多糖:准确称取山药汁液喷雾干燥粉，用30倍蒸馏水将其溶解，加入70倍体积的无水乙醇，4℃过夜沉淀，3 000 r/min离心10 min，收集沉淀，干燥得粗多糖。以Sevag法除蛋白得山药汁液多糖［5］。

DPPH(1，1－二苯基苦基苯肼自由基)、Tris(三羟甲基氨基甲烷):美国Sigma公司;30%过氧化氢:天津市风船化学试剂科技有限公司;印度墨汁和补体:上海信然生物技术有限公司;高铁氰化钾等化学试剂均为分析纯。

UNICO WFJ2000型可见光光度计:尤尼柯仪器有限公司;SY－6000小型高速喷雾干燥仪:上海世远生物机械设备工程有限公司。

1．2 试验动物及分组

ICR小鼠(SCXK(晋)2007－0001)，SPF级，雄性，体重20～25 g，6～8周龄，160只，由山西医科大实验动物研究中心提供。试验过程中按照3R原则给予小鼠人文主义关怀。基础饲料由山西医科大学实验动物中心提供。各试验均取40只小鼠，随机分成4组，每组10只，分笼饲养，环境温度为(24±2)℃，相对湿度40%～60%，自由采食和饮水，适应性饲喂3 d后，开始正式试验。山药多糖低、中、高剂量组的灌胃(ig)剂量分别为200、600 mg/(kg·d)，空白对照组灌胃等体积的蒸馏水。

1．3 体外抗氧化试验

1．3．1 还原力测定

取pH 6．6的磷酸缓冲液和1%铁氰化钾溶液各2．5 mL，加入样品液l mL，混匀后50℃水浴20 min，然后加入质量分数为10%三氯乙酸溶液2．5 mL，混匀，3 000 r/min离心10 min，取上清2．5 mL，加入蒸馏水和0．1%氯化铁各2．5 mL混匀，静置10 min，在700 nm处测定吸光度值，吸光度值越高，抗氧化性越好，还原力越强。

1．3．2 对DPPH·清除能力的测定

取样品液2 mL，加入2 mL 0．000 1 mol/L DPPH溶液(溶于95%的乙醇)，混匀后在室温下避光反应20 min，1 000 r/min离心10 min，在517 nm处测吸光度值Ai;空白组为2 mL样品液加入2 mL 95%的乙醇溶液测定吸光值为Aj;对照组为2 mL DPPH溶液与2 mL蒸馏水混合在517 nm下测吸光值为Ac;并以等体积蒸馏水和95%的乙醇混合液作为空白调零。清除率按下式计算［6］。

1．3．3 对·OH清除能力的测定

样品组试管中依次加入pH值为7．4的0．4 mol/L磷酸缓冲液，0．002 5 mol/L邻二氮菲溶液，样品液，0．002 5 mol/L硫酸亚铁溶液各1 mL，0．02 mol/L H2O20．5 mL;损伤组中用l mL蒸馏水代替样品液;空白组中用1．5 mL蒸馏水代替样品液和H2O2溶液。37℃恒温水浴中反应l h，快速记录536 nm处的吸光值。按下式计算样品对·OH的清除率［7］。

式中:A样品为加入样品液的·OH体系的吸光值;A空白为不加H2O2的·OH体系的吸光值;A损伤为加H2O2不加样品液的·OH体系的吸光值。

1．3．4 对O2·-清除能力的测定

依次加入4．5 mL 0．050 mol/L pH8．34的磷酸缓冲液，0．3 mL 0．000 2 mol/L邻苯三酚，0．3 mL样品，蒸馏水补充至9．0 mL。25℃反应，5 min内，每30 s读取一次322 nm处的吸光值。用蒸馏水代替样品液，以吸光值A与时间t做线性关系图，斜率即为邻苯三酚的自氧化速率V0。对于加入样品液后的反应体系，求出的斜率即为加入样品液后邻苯三酚的自氧化速率Vt。按下式计算样品对O2·-的清除率。

1．4 免疫活性试验

免疫分为非特异性的先天性免疫和特异性的获得性免疫，获得性免疫又分为体液免疫和细胞免疫。评价某种物质对免疫功能的影响时，应该对组成免疫力的上述三方面进行全面评价，每一方面的评价又有许多不同的方法，本研究分别选取了碳粒廓清试验、血清溶血素试验、绵羊红细胞(SRBC)诱导DTH试验分别对山药多糖的非特异性免疫、体液免疫和细胞免疫的调节作用进行研究。

1．4．1 小鼠免疫脏器指数的测定

连续灌胃3周，末次灌胃第2天对小鼠称重，摘眼球放血处死，剥取脾脏，将周围组织剥离干净后称重，免疫脏器指数按下式计算。

脾脏指数(mg/10 g)=脾脏质量(mg)/体重(10 g)

1．4．2 碳粒廓清试验

连续灌胃3周，末次给药30 min后，小鼠尾静脉注射印度墨汁(生理盐水稀释4倍，0．1 mL/10 g bw)。注射墨汁立即计时，1、5 min分别从小鼠的眼静脉丛取血20μL，立即将其加到2 mL 0．1%Na2CO3溶液中，摇匀，在波长680 nm处测定吸光值，以0．1%Na2CO3溶液作空白。将小鼠颈椎脱臼处死，取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，分别称重。按下式计算。

式中:K为吞噬速率或廓清指数;吞噬指数α为碳廓清能力［8］;A1、A2为在时间为t1、t2时所取血样的吸光值;t2－t1为取两血样的时间差。

1．4．3 绵羊红细胞诱导小鼠迟发型变态反应(DTH)

足跖增厚法:在灌胃第3周，每只小鼠腹腔注射0．2 mL 2%绵羊红细胞(SRBC)。免疫后4 d，用游标卡尺测量左后足跖部厚度，然后于测量部位皮下注射20%SRBC，每只鼠注射20μL。注射后于24、48 h分别测量左后足跖部厚度，同一部位测量3次。

1．4．4 血清溶血素的测定

用SRBC免疫后，小鼠体内产生抗SRBC抗体(溶血素IgM)，与SRBC一起孵育，在补体参与下，可产生溶血反应，释放血红蛋白，血红蛋白含量反映了动物血清中溶血素的含量。连续灌胃3周后，每只小鼠腹腔注射0．2 mL 20%SRBC进行免疫，4 d后，摘除眼球取血，2 000 r/min离心10 min，收集血清，用生理盐水500倍稀释，吸取l mL于试管，依次加入0．5 mL 10%SRBC，1 mL补体(生理盐水1∶10稀释);用生理盐水代替血清作空白对照，37℃保温10 min，冰浴终止反应。2 000 r/min离心10 min，取上清液1 mL加3 mL都氏试剂(1．0 g NaHCO3、0．05 g氰化钾、0．2 g高铁氰化钾加蒸馏水溶解并定容至1 000 mL)于试管内，同时取0．25 mL 10%SRBC用都氏试剂稀释至4 mL于另一支试管中(用于测定SRBC半数溶血吸光值)，各试管混匀后静置10 min，于540 nm测吸光度值。按下式计算半数溶血值(HC50)。

1．4．5 数据分析

所有数据以均数±标准差表示，采用SPSS10．0统计软件包进行方差分析，各组间比较采用单因素方差分析。

2 结果与分析

2．1 山药多糖的还原力

一般情况下，物质的还原能力越强，抗氧化活性也越高。样品反应后的生成物在700 nm处的吸光度值越大则样品的还原能力越强。如图1所示，山药汁液多糖在2 mg/mL的浓度范围内，还原力随着浓度的升高呈稳定的增加趋势，表明其具有一定的还原力。

图1 山药多糖对还原体系吸光值的影响

2．2 对DPPH·清除能力

图2可见，随着浓度增加清除率逐渐上升，当质量浓度8 mg/mL时对DPPH·清除率达到92．73%，此后维持在稳定水平，表明山药多糖对DPPH·有良好的清除能力。

图2 山药多糖对DPPH·清除作用

2．3 对·OH清除能力

如图3所示，山药汁液多糖对·OH有良好的清除能力。在试验浓度范围内，随着多糖浓度的增加，对·OH清除率不断增强。当浓度达到4 mg/mL时，对·OH清除率达到84．72%。

图3 山药多糖对·OH的清除作用

2．4 对O2·-清除能力

邻苯三酚在碱性条件下迅速氧化产生O2·-和有色中间产物，产生的O2·-能加速邻苯三酚氧化速率和有色中间产物的生成;有色中间产物在322 nm处有强烈的光吸收;加入抗氧化物质可以清除O2·-，从而能抑制邻苯三酚的自氧化反应，阻止有色中间产物的积累;所以在322 nm处比色，可以评价样品清除O2·-的能力［9］。

图4 邻苯三酚自氧化速率的测定

如图4所示，邻苯三酚自氧化体系吸光值与反应时间呈线性相关，相关系数为0．996 6，计算斜率得知邻苯三酚自氧化速率V0为0．047 7。

图5 山药多糖对O2·-的清除作用

由图5可知，在所试浓度范围内，山药多糖对O2·-的清除率随着浓度的增大而增加。但对O2·-的清除能力需要较高的浓度，当多糖质量浓度为20 mg/mL时，对O2·-的清除率方可达到89．14%。

2．5 对小鼠免疫脏器指数的影响

如表1所示，各剂量组相对空白对照组小鼠脾脏均有一定的增重效果。与空白对照组相比，随着剂量的增加脾脏指数呈增加趋势。高、中剂量组脾脏指数极显著高于空白对照组(P＜0．01)。免疫器官是免疫细胞发生和增殖的场所，机体免疫力的强弱取决于免疫器官的状况，脾脏是机体最大的免疫器官，是B淋巴细胞和T淋巴细胞定居的场所，本研究结果表明山药多糖能显著促进免疫器官的发育，从而可调节机体免疫力。

表1 山药多糖对小鼠免疫器官脏器指数的影响(珔X±S，n=10)

2．6 对吞噬细胞吞噬能力的影响

吞噬细胞的吞噬能力是构成非特异性免疫的要素之一，吞噬细胞也是一类主要的抗原呈递细胞，在特异性免疫应答的诱导与调节中起关键作用，校正吞噬指数可反映吞噬能力的强弱和非特异性免疫功能的变化。

如表2所示，与空白对照组相比，碳粒廓清指数和吞噬指数随着剂量的增大均有升高趋势。对于吞噬指数，中剂量组和高剂量组与空白对照组相比，差异均极显著;对于廓清指数，中剂量组显著提高，高剂量组极显著提高。

表2 山药多糖对小鼠碳廓清能力的影响(珔X±S，n=10)

2．7 对绵羊红细胞(SRBC)诱导的DTH的影响

各组小鼠由SRBC诱导迟发型变态反应(DTH)，24 h和48 h足跖厚度的测量值如表3所示，随着剂量的增加和时间的延长小鼠的足跖厚度均呈增厚趋势，与对照组相比，低中剂量组增厚不显著，但高剂量组极显著增厚(P＜0．01)。

表3 山药多糖对小鼠足跖厚度的影响(珔X±S，n=10)

2．8 血清溶血素的测定

在体外，抗SRBC抗体与SRBC特异性结合，在补体的参与下导致红细胞裂解，发生溶血，所释放的血红蛋白量可反映抗体的生成量，在一定程度上反映了机体体液免疫功能的强弱［10］。半数溶血值(HC50)越大，血清中的溶血素含量就越高。经测定和计算，各组小鼠的HC50值分别为58．168±6．958(空白 对 照 组)、64．158±6．012(低 剂 量 组)、68．021±8．325*(中剂量组)、75．036±6．518＊＊(高剂量组)。可见，随着灌胃剂量的增大，HC50也逐渐加大，呈剂量效应。与对照组相比，中剂量组显著增大(P＜0．05)，高剂量组极显著增大(P＜0．01)。

3 讨论

3．1 山药多糖的体外抗氧化活性

对其抗氧化能力的各种指标进行比较，还原力最强，对·OH和对DPPH·的清除能力次之，对O2·-的清除能力最弱。自由基的氧化损伤与许多疾病的发病机理有关，人体通过适当摄入具有抗氧化活性的物质可以降低体内自由基水平，防止脂质过氧化［11］。脂质过氧化与衰老密切相关，甚至诱发许多疾病。寻找能抑制脂质过氧化的抗氧化剂一直是营养生物化学领域研究热点。BHA、BHT等化学合成物抗氧化效果虽好，但对人体肝、脾、肺有害，具有蓄积性致癌作用［12］。本研究利用化学模型表明山药多糖具有较强的抗氧化作用，为以后安全有效、具营养作用、天然抗氧化剂的开发提供了新资源。

3．2 山药多糖的免疫增强作用

山药多糖可显著提高正常小鼠外周血中吞噬细胞清除碳颗粒的能力，因而具有增强非特异性免疫的功能。其机理可能是山药多糖中的某些成分作为一种免疫激活剂，激活大量处于静息状态的巨噬细胞，同时又显著提高了已经处于活化状态的巨噬细胞的吞噬功能。山药多糖对体液免疫的正调节作用，是由于提高了浆细胞分泌特异性抗体的能力，还是促进了B淋巴细胞增殖和分化的能力，还有待进一步研究。山药多糖也能明显促进迟发型变态反应的发生，说明其具有促进细胞免疫的功能。可见，山药多糖可促进免疫器官的发育，有效促进机体的非特异性免疫、体液免疫应答和细胞免疫应答能力，并表现出一定的剂量效应，因而可促进机体的免疫应答能力。

3．3 山药的综合开发利用

本研究山药汁液干粉是山药提取淀粉时分离的汁液经喷雾干燥而得，其主要成分是山药的水溶性物质，经测定多糖质量分数为21．6%、黏液蛋白质量分数为33．2%，因此对山药汁液干粉中黏液蛋白的提取与功能性研究也很重要，这些研究对山药汁液干粉的开发应用是必不可少的。

山药提取淀粉时收集得纤维残渣不仅含有丰富的膳食纤维，而且也含有较多的山药多糖，纤维残渣中的多糖与汁液干粉中的多糖是否相同还有待于进一步研究，对于纤维残渣中的多糖和膳食纤维的提取与功能性研究也是研究山药精深加工的重要内容。

4 结论

山药提取淀粉后，从汁液干粉中提取的山药多糖，体外研究表明具有抗氧化能力，对DPPH·、·OH及O2·-的清除率分别达到92．73%、84．72%、89．14%;正常小鼠体内研究结果表明具有增强机体免疫功能的能力，为以后相关功能性食品和食品添加剂的开发以及山药的综合开发利用奠定了研究基础。

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In Vitro Anti－Oxidation Capacity and Immunomodulatory Efficacy in Mice of Yam Polysaccharide

Xu Xiaoqun1Liu Zhifang2Huo Nairui1Zhao Yuan1Tian Xia1Lei Tingting1
(College of Food Science and Engineering，Shanxi Agriculture University1，Taigu 030801)
(Shanxi Agriculture University Affiliated Hospital2，Taigu 030801)

In vitro anti－oxidation capacity and immunomodulatory function in normal mice of yam polysaccharide were investigated in this study．The results demonstrate that the reducing power was enhanced with the increase of the concentration．The scavenging rate for DPPH·，·OH and O2·-were up to 92．73%，84．72%and 89．14%respectively and exhibited a linear relationship．Compared with normal mice group，both the medium and high dose group significantly increased the spleen index，the phagocytic index and serum hemolytic IgM level，and high dose groups were especially higher(P＜0．01)．the thickness of foot pad of high dose group were also significantly increased(P＜0．01)during the induced delayed type hypersensitivity．Therefore yam polysaccharides showed good anti－oxidation and immuno－enhancing capacity，this provides a new source of safe and natural antioxidant and immunomodulatory agents for future food production and also facilitates further comprehensive exploitation and application of Chinese Yam．

yam polysaccharide，antioxidant capacity，immune enhance ability

R151．1

A

1003－0174(2012)07－0042－06

时间:2012－05－31 16:46

网络出版地址:http://www．cnki．net/kcms/detail/11．2864．TS．20120531．1646．003．html

山西省科技攻关项目(2007031076)

2011－11－03

许效群，男，1963年出生，副教授，粮油加工