微胶囊化葡萄糖氧化酶对面团氧化作用研究

王 霞 张天亮 周惠明

微胶囊化葡萄糖氧化酶对面团氧化作用研究

王 霞1张天亮1周惠明2

(潍坊医学院1，潍坊 261053)
(江南大学食品学院2，无锡 214122)

以游离葡萄糖氧化酶(GOD)作对比，根据面团保温过程中小麦粉湿面筋(WG)含量、水溶性蛋白巯基(W－SH)含量和SDS可溶性蛋白巯基(SDS－SH)的变化，研究以海藻酸钠－壳聚糖为壁材的微胶囊化葡萄糖氧化酶(CAGC)对面团中—SH的氧化速度及程度;结合面团动态流变学特性以及电子显微结构观察，检验CAGC对面团面筋结构的改良效果。结果表明:微胶囊化以后CAGC在面团中的氧化速度减慢，作用时间增长;添加CAGC的面团其黏弹性(G*)、回复性(ε(t))、聚合度(tanδ)及显微网络结构均优于游离GOD。

微胶囊 葡萄糖氧化酶 湿面筋 流变学 显微结构

葡萄糖氧化酶(GOD)是最受关注的小麦粉改良剂之一，属强筋剂类，能氧化葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢(H2O2)，后者氧化面筋蛋白中的巯基生成二硫键，从而大大改善面筋的组织结构［1－2］。目前，GOD被公认为最有可能替代溴酸钾的酶制剂［2－3］，但仍有诸多不足之处:首先GOD属于快速氧化剂，催化速度很快，在面团形成过程中就已经生成了大量的H2O2，后者快速氧化蛋白中的游离—SH，使面团变干变硬，导致面制品的品质变差［4－6］;其次，GOD在小麦粉介质中稳定性差，在面团形成的前2 min酶活力就损失了25%，接下来的20 min内又有20%的酶失活［6－7］，因此GOD的作用效果不够理想。

试验中的微胶囊化工艺是将芯材GOD包埋于海藻酸钠－壳聚糖微胶囊中(CAGC)［8］，使GOD与外界环境隔离，以提高酶的稳定性;同时通过调节微胶囊的壁膜厚度及孔洞大小控制GOD的催化速度，从两方面改善GOD的作用效果。本试验通过比较保温过程中CAGC和GOD对湿面筋含量、水溶性蛋白—SH含量及SDS可溶蛋白—SH含量的影响，研究CAGC在面团中对小麦蛋白的氧化速度，并通过动态流变学和显微结构从微观上验证其改良效果。

1 材料与方法

1．1 材料

中筋粉:“南山”牌超级粉，江苏省银河面粉有限公司。基本组成成分为:水分质量分数13．3%、粗蛋白10．32%、湿面筋27．4%以及灰分0．60%。葡萄糖氧化酶:“Gluzyme Mono”，酶活力10，000 U/g，丹麦诺维信公司;微胶囊化葡萄糖氧化酶(CAGC)为实验室自备［8］，酶活力为733 U/g(以CAGC干基质量为基准)。三羟甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、十二烷基磺酸钠(SDS)和其他试剂均为分析纯，上海国药集团。

E型粉质仪、E型拉伸仪:德国Brabender公司;UV－2800紫外可见分光光度计:尤尼柯仪器有限公司;AR1000动态流变仪:英国TA公司;Quanta－200扫描电子显微镜:荷兰Fei公司。

1．2 方法

1．2．1 湿面筋含量(WG)的测定

5种样品面团分别添加0(空白组)、300 U/kg GOD、300 U/kg CAGC、600 U/kg CAGC或1 000 U/kg CAGC。准确称量49．5 g样品小麦粉置于粉质仪50 g面缸中，加入60%的去离子水(含添加酶)，25℃下搅拌3．0 min，将形成的面团以保鲜膜包裹，25℃下分别保温10、30、90 min。以去离子水洗涤面团，洗涤过程中不断用手指压挤面团，反复压平、卷叠滚团，至用碘液检查无颜色，称量湿面筋(WG)的质量，精确至0．01 g。

1．2．2 巯基(—SH)含量的测定

面团的制备按1．2．1的方法进行，25℃下分别保温10、30、90 min。根据Beveridge等［9］的方法，Ellman试剂比色测定412 nm处吸光度，以粗蛋白为基准计算水溶性蛋白中—SH含量(W－SH)和1．5%的SDS可溶性蛋白中—SH含量(SDS－SH)，单位为μmol/kg。

1．2．3 黏弹特性的测定

通过动态流变仪振荡模式下的频率扫描实验研究CAGC对面团黏弹性的影响。面团的制备按1．2．1方法进行，25℃静置保温30 min。仪器测试条件为:4 cm平板;狭缝距离2 mm;振荡应力30%，应变振幅小于1%;扫描频率0．01～20 Hz;温度25℃。面团在两板之间再静置5 min，以松弛残余应力。

1．2．4 蠕变回复性测定

足球课中，如果学生能够自觉的遵守课堂规则，那么达到良好的课堂秩序就会事半功倍。形成良好的自律品质需要一个过程，需要教师不断对学生进行教育。1、教师要对学生提出明确的要求，进行足球课堂纪律的目的性教育。2、引导学生正确地看待足球课堂纪律，产生对纪律的积极体验。并且能够逐步进行自我监控。3、发挥集体舆论的作用。积极的集体舆论的形成需要教师的引导。发动学生参与课堂管理，互相监督，互相提醒。

通过动态流变仪静态蠕变回复性实验研究CAGC对面团黏度和回复性的影响。面团的制备与

1．2．3 相同，仪器测试条件:2 cm平板;狭缝距离2 mm;蠕变过程剪切应力50 Pa，保持100 s，回复过程剪切应力0 Pa，测定200 s内回复性;应变振幅小于1%;扫描频率0．01～20 Hz;温度25℃。面团在两板之间静置5 min，以松弛残余应力。

1．2．5 面筋显微结构观察

面团制备按1．2．1的方法进行，25℃下保温90 min，面筋的洗涤方法按1．2．1所述，洗涤后轻轻挤压并冷冻干燥。面筋样品用戊二醛固定，采用溅射镀膜法对样品进行表面镀金，然后置于扫描电镜下观察。

2 结果与分析

2．1 CAGC对湿面筋含量的影响

图1给出了不同保温时间后各样品面团中WG的变化:随保温时间的延长，空白组WG有下降趋势，保温90 min后WG下降4．61%。推测可能的原因为小麦粉自身含有的蛋白酶，在小麦粉吸水后被半胱氨酸中的—SH基团所激活，分解了面筋中的一部分高分子质量蛋白大聚体(GMP)，破坏了面筋结构，使得湿面筋含量下降［10］。另外，保温过程中面筋蛋白的肽链逐渐展开，链间部分—S—S—和氢键等次级键被打断，然后与毗邻的肽链又重新键合。二硫键的打开与重新聚合过程中，部分贫硫蛋白亚基(如ω－醇溶蛋白)不参与面筋网络的形成，被洗脱下来，从而导致WG下降［11］。

加入CAGC后3个保温时间段的WG均有所提高，CAGC添加量的增加也有利于WG的增加。对比添加300 U/kg GOD与300 U/kg CAGC的WG变化可以看出:GOD对面团作用很快，保温10min后WG达到28．06%，显著高于空白组(27．42%)和添加相同酶活力的CAGC组(27．56%)。随着保温时间延长，GOD对WG的影响减弱，保温90 min时的WG仅为27．32%，略低于保温30 min时的27．86%。CAGC的氧化速度明显慢于GOD，其对WG的影响在保温过程中逐渐显现出来。

图1 CAGC和GOD对面团湿面筋含量的影响

2．2 CAGC对—SH含量的影响

GOD和CAGC的添加降低了面团中W－SH和SDS－SH的含量。两者对比可发现:GOD在加水初期氧化—SH的速度非常快，保温10 min后面团WSH和SDS－SH含量下降幅度(与空白组相比)分别是CAGC组(300 U/kg)的4．8和2．3倍，而随着保温时间的延长，—SH的下降速度变慢;与WG的变化规律相同，CAGC对W－SH和SDS－SH的氧化是在保温90 min内逐步完成的，其氧化速度较慢、作用时间更长、最终的氧化效率更高。

图2 CAGC和GOD对W－SH和SDS－SH含量的影响

2．3 CAGC对面团黏弹特性的影响

模量G*=(G'2+G″2)1/2，可体现面团的黏弹特性，而损耗角正切值tanδ是弹性模量(G')与黏性模量(G″)的比值，可反映出面团中高聚物的比例，tanδ越小体系组分中高聚物的数量越多或聚合度越大［13］。如图3所示，面团的G*随CAGC添加量的增加逐渐增高，这表明面团的黏弹特性得到改善，面团的耐揉性和可操作性变好;同时tanδ值下降，表明面团中高聚物的数量增多，聚合度增大。近年来大量研究表明，tanδ与面筋蛋白中GMP的含量呈显著的负相关性［11，13］，而后者直接决定了小麦粉的焙烤品质［5，13－14］。CAGC的氧化作用有利于低分子质量谷蛋白亚基(LMW－GS)和小分子蛋白的交联聚合，提高了面筋蛋白的聚合程度，表现为tanδ的下降。与CAGC相比，添加相同酶活力时(300 U/kg)GOD对G*的影响与CAGC相接近，而tanδ远低于CAGC，表明GOD的氧化作用过快，不利于GMP的聚合。

图3 CAGC和GOD对面团黏弹特性的影响

2．4 CAGC对面团蠕变回复性的影响

在面团线性黏弹区内进行蠕变－回复特性的研究。首先给样品面团一个恒定的应力(σ(t)=σ0)，记录面团在100 s内应变ε(t)随时间的变化，称为蠕变阶段;随后应力(σ(t))全部解除，记录200 s内已发生的应变ε(t)随时间的变化，称为回复阶段［15］。

图4 CAGC和GOD对面团蠕变－回复性的影响

如图4所示，CAGC和GOD的添加都提高了面团的应变ε(t)，表明面团的黏度η下降，在相同应力下面团的形变比例下降，黏弹性得到改善。对比添加300 U/kg CAGC和GOD的面团，前者的蠕变 ε(t)略高于后者，而回复能力却显著优于后者，同时随CAGC添加量增大，面团的回复能力大幅度提高。刘国琴等［15］和Agyare等［16］研究发现，面团的回复能力和面筋的强度呈正相关性，面筋结构合理、筋力强时，应力消除后能较快速的回复到平衡值，同时可回复的比例提高(高聚物存在连续流变，回复时变形不可能完全回复)。结合CAGC与GOD对tanδ的影响，再次证明CAGC的氧化速度更为合理，面筋网络结构改善，面团的弹性和回复性变好。

2．5 CAGC对面团显微结构的影响

面筋是小麦粉蛋白质中非极性醇溶蛋白和极性较大的麦谷蛋白在吸水膨胀后形成的网状结构。由图5观察可知，空白组面筋(图5a)的结构均匀而规则，在保温过程中面筋蛋白互相交联，麦谷蛋白分子内和分子间的—SH和—S—S—不断发生交换形成有序网络结构，淀粉在面筋制备过程中被洗脱掉，使面筋蛋白呈现较规则的蜂窝状结构。添加300 U/kg GOD后(图5b)，面筋蛋白的聚集性得到改善，网孔变大出现较大的孔洞结构，这也直观地证明了GOD可加强面筋网络的形成［5］。添加300 U/kg CAGC时(图5c)，面筋蛋白原来的蜂窝状结构消失，出现片状面筋网络，但该网络的壁膜厚度不一，孔洞的规则性也较差。CAGC的添加量提高到600 U/kg时(图5d)，面筋网络的壁膜厚度和均一性得到改善。添加1 000 U/kg CAGC面筋网络更加合理(图5e)，面筋形成大量的孔洞，壁膜薄，表面光滑且连续性优于其他各试验组。这种结构表明此时的麦谷蛋白和醇溶蛋白组合更为合理，麦谷蛋白亚基间通过二硫键形成有序的纤维状大分子聚合体，醇溶蛋白填充在聚合体内，形成规则而光滑的片状结构，这有利于面团发酵时的持气性和黏弹性，使制作的面制品多孔且松软［4］。

图5 CAGC和GOD对面团显微结构的影响

3 讨论

综合分析GOD对WG、W－SH和SDS－SH含量的影响，以及保温后面团黏弹性(G*)、回复性(ε(t))、聚合度(tanδ)和显微结构变化后可以看出，GOD在保温前10 min内对面团的氧化作用最为快速，后80 min速度变慢，同时与CAGC相比最终面筋蛋白的聚合度较低，回复性较差，未形成片状面筋网络结构。分析可能的原因有4点:首先，GOD在面团体系内的稳定性较差，易发生物理化学变性［6－7］，Rakotozafy等［7］报道GOD在面团形成20 min后失活率达35%;其次，Rakotozafy等［7］还发现GOD的加入降低了面团自身含有的过氧化氢酶(POD)的稳定性，POD的失活使GOD对—SH的氧化能力下降;再次，GOD在小麦粉加水过程中就快速发挥其活性，底物—SH含量的快速下降也不利于后期的氧化反应;最后，GOD在面团形成过程中催化产生的大量H2O2，使搅拌过程中二硫键断裂生成的—SH在短时间内再次氧化交联，而这种交联是随机的，不具有选择性，谷蛋白亚基上许多敏感位点的—SH被小分子蛋白占据，不利于面筋蛋白空间结构的舒展，同时敏感位点—SH的减少和小分子蛋白的引入都阻碍了麦谷蛋白—SH和—S—S—的交换反应，不利于GMP的形成［2，17－18］。

经过海藻酸钠－壳聚糖微胶囊化以后(CAGC)，酶分子被包埋在微胶囊的内部，微胶囊壁膜可以从3个方面提高酶的稳定性:首先，壁膜阻隔GOD与面团的直接接触，保护酶的天然结构不被面团内蛋白酶等失活因子破坏［19］;其次，壁膜的包裹减少了GOD辅基FAD的逃逸，提高了酶的稳定性;最后，微胶囊的多孔蛋格结构具有一定的“刚性”，有利于GOD天然构象的保持［19］。另外，CAGC微胶囊在面团中有个吸水膨胀的过程，微胶囊吸水后膜上的网口逐渐舒张开，面团里的GOD底物－β－D葡萄糖可以进入微胶囊内部被氧化生成H2O2，进而氧化面筋蛋白里的—SH［20］。微胶囊壁膜的吸水膨胀和传质阻力使CAGC的氧化起始时间推后、氧化速度减慢。结果表明，添加相同酶活力的CAGC在保温后的氧化效果比GOD更为优良，表现为面筋蛋白聚合程度较大(tanδ下降)，回复能力较强，显微结构也更为合理。

综上所述，海藻酸钠－壳聚糖微胶囊化以后的CAGC在面团中的氧化速度减慢，作用时间增长，最终的氧化程度和面团各项品质均优于游离GOD。

4 结论

4．1 空白组面团WG和SDS－SH的含量随保温时间的延长有下降趋势，而W－SH略有上升。CAGC和GOD均提高了面团的WG，降低了W－SH和SDSSH含量。GOD氧化速度很快，在保温10 min内作用最为明显，而CAGC的氧化速度较慢，在保温90 min内逐渐发挥作用。

4．2 海藻酸钠－壳聚糖微胶囊化以后，CAGC的酶活力稳定性提高、氧化速度减慢、作用时间延长;面团保温90 min后的聚合程度提高、回复能力增强、面筋蛋白形成壁膜薄、表面光滑且连续性好的片状网络结构，面团持气能力和焙烤品质提高。

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RearchontheEffectsofMicroencapsulatedGlucose OxidaseontheOxidationofDough

WangXia1ZhangTianliang1ZhouHuiming2
(WeifangMedicalCollege，MajorofFoodQualityandFoodSafety1，Weifang261053)
(FoodCollegeofJiangnanUniversity2，Wuxi214122)

Withfreeglucoseoxidase(GOD)ascomparison，thespeedanddegreeofoxidationofSHwasstudied byvariationsofwetglutenwheatflour(WG)content，solubleproteinthiol(W － SH)contentandSDSsolubleprotein thiolcontent(SDS－SH)duringincubation．Bymeansofdynamicrheologicalpropertiesofdoughandmicrostructure observation，theoxidationeffectofCAGC(wallmaterialforsodiumalginate － chitosan)ondoughwasverified．TheresultsdemonstratethattheoxidationofCAGCindoughslowedwhileenzymedurationofactionincreased．Moreover，theviscoelasticproperties(G*)，creep － recovery(ε(t))，degreeofpolymerization(tanδ)andmicroscopicstructures weresuperiortothatoffreeGOD．

microencapsulate，glucoseoxidase，wetgluten，rheological，microstructure

TQ925+．4

A

1003－0174(2012)07－0017－06

国家科技支撑计划(2006BAD05A09)

2012－02－14

王霞，女，1982年出生，讲师，粮食、油脂及植物蛋白

周惠明，男，1957年出生，教授，博士生导师，粮食、油脂及植物蛋白