死亡番鸭胚中绿脓杆菌的分离鉴定及药敏试验

陈红梅，程龙飞，万春和，施少华，傅光华，黄 瑜

（1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福建 福州350013；2.福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心，福建 福州350013）

绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）也称铜绿假单胞菌，是假单胞菌属的代表菌种，是具有荚膜、鞭毛和无芽孢的革兰阴性杆菌。该菌广泛分布于自然界，对环境抵抗力较强，是常见的条件致病菌之一。随着家禽养殖业的不断规模化发展，绿脓杆菌感染家禽变得越来越常见，对养殖业造成一定的损失。近年来，本病在辽宁、北京、天津、河北、四川和福建等地均有发生，其主要原因是注射污染、环境恶劣、营养不良、运输等应激因素［1］。在关于绿脓杆菌致死胚的报道中，最常见的是对鸡胚的侵害［2－4］，其次是对鹅胚［5］，但目前对番鸭胚的侵害未见报道。

2010年以来，福建某大型番鸭孵化场自番鸭胚入孵后不时出现死亡，死亡率约为10%。为了寻找番鸭胚死亡原因，笔者对送诊的死亡番鸭胚进行病原学检测和药敏试验。

1 材料与方法

1.1 病料样品 病料样品来源于福建省某大型番鸭孵化场的死亡番鸭胚20枚。

1.2 主要试剂 血琼脂平板，购自OXOID公司；细菌生化反应管与药敏试纸，均购自杭州天和微生物试剂有限公司；其他试剂均为分析纯；普通营养琼脂平板、麦康凯琼脂平板以及普通肉汤自制。

1.3 试验胚与试验动物 试验胚来自某孵化场的10日龄番鸭胚，试验动物为购置健康鸭场7日龄的雏番鸭。

1.4 细菌的分离培养与纯化 无菌条件下取死亡番鸭胚的尿囊液，适当稀释后分别划线接种于普通营养琼脂平板、麦康凯琼脂平板和血琼脂平板上，37℃培养18～24h后取出，挑取其中单一的菌落进行纯化，再将纯化后的菌落于普通肉汤中37℃、150 r／min进行振荡培养。普通营养琼脂平板置4℃继续观察。

1.5 病毒的分离 将死亡番鸭胚的尿囊液反复冻融3次后，8 000r／min离心5min，取上清，用0.22 μm的滤膜过滤，滤过液接种2枚10日龄番鸭胚，每枚0.2mL，37℃孵化，每天观察2次，连续观察7d，另设空白对照。接着收取第一代的尿囊液，并将此尿囊液盲传3代。

1.6 革兰染色镜检 采用常规方法进行革兰染色，普通光学显微镜下观察菌体形态。

1.7 生化试验 挑取纯培养的单菌落接种细菌生化微量鉴定管，37℃培养24h观察生化试验结果。

1.8 药敏试验 采用纸片扩散法，检测分离菌株对18种常用抗菌药物的敏感性。判断标准参照中国药检所制定的标准。

1.9 动物回归试验

1.9.1 番鸭胚的接种 取分离菌肉汤培养液经尿囊腔接种10枚番鸭胚，每枚接种0.2mL（108CFU／mL），同时设立对照番鸭胚5枚，每枚接种生理盐水0.2mL。将15枚番鸭胚置37℃温箱中直立孵化，每天观察3次并记录胚胎存活情况，连续观察3天。番鸭胚死亡后剖检观察记录其病理变化，同时无菌操作将尿囊液接种于普通营养琼脂平板分离培养菌 。

1.9.2 雏番鸭的接种 取分离菌肉汤培养液，肌肉注射健康7日龄的雏番鸭15只，每只0.2mL（108CFU／mL）。同时设立对照雏番鸭5只，每只肌肉注射生理盐水0.2mL。每天观察2次并记录其发病情况。雏番鸭发病死亡后剖检观察，记录其病理变化，同时无菌操作将肝脏接种普通营养琼脂平板分离培养菌。

2 结果

2.1 病原分离与培养特性观察

2.1.1 细菌分离 根据普通营养琼脂平板、麦康凯琼脂平板和血琼脂平板上菌落生长情况，筛选出1株优势菌，该优势菌在普通营养琼脂上生长为微隆起、光滑、湿润、半透明、边缘不整齐（试管刷状）的中等大小的菌落，数日后观察，发现菌落及整个培养基均呈绿色；在麦康凯琼脂培养基上形成无色、半透明的圆形菌落；而在血液琼脂培养基上长出灰色、边缘不整齐的较大菌落，能形成β溶血环。普通肉汤呈绿色、混浊，表面有菌膜。镜检结果是两端钝圆、长短不一的革兰阴性的细长杆菌。

2.1.2 病毒分离 盲传三代后，未见番鸭胚死亡，可见送检的死亡番鸭胚无病毒感染。

2.2 生化试验 由表1可知，所分离的细菌能分解葡萄糖产酸不产气，不分解乳糖、甘露醇、麦芽糖、蔗糖、菊糖、木糖、阿拉伯糖、卫矛醇、半乳糖、果糖、棉子糖；不产生H2S，能还原硝酸盐，M.R.试验和VP试验均为阴性。生化试验结果与绿脓杆菌生化特性相符。

表1 分离菌的生化反应结果

2.3 药敏试验 药敏结果（表2）显示，该分离菌对环丙沙星高敏；对丁胺卡那霉素、多黏菌素、链霉素、庆大霉素、氧氟沙星中敏：对氨苄青霉素、阿莫西林、红霉素和壮观霉素等低敏。

表2 分离菌药敏试验结果

2.4 动物回归试验

2.4.1 番鸭胚的接种结果 试验组接种48h后的番鸭胚全部死亡，胚体水肿，出血，并从死亡番鸭胚的尿囊液中重新分到绿脓杆菌。对照组的番鸭胚孵化良好。

2.4.2 雏番鸭的接种结果 试验组接种24h后雏番鸭开始出现死亡，到48h内雏番鸭全部死亡，对照组雏番鸭健康。剖检死亡雏番鸭，可见肝淤血和胰腺出血，并从死亡雏番鸭的肝脏中重新分离到该菌。

3 讨论与小结

3.1 本试验从死亡番鸭胚中分离了1株细菌，通过对分离细菌的染色镜检、分离培养、生化试验，以及动物回归试验的结果，确定福建某大型番鸭孵化场番鸭胚死亡的原因为绿脓杆菌感染引起。

3.2 绿脓杆菌普遍存在耐药性，应当参照药敏试验的结果选择敏感的药物，使用敏感的药物进行对症治疗，最大限度地减少养殖户的损失。本试验所分离的绿脓杆菌对环丙沙星高度敏感；对丁胺卡那霉素、多黏菌素、链霉素、庆大霉素、氧氟沙星中度敏感；与目前使用频率比较高的药物如庆大霉素、新霉素和环丙沙星等较为相近。

3.3 绿脓杆菌是条件致病菌，广泛存在于水、土壤、空气和动物的肠道和皮肤中。引起该菌污染胚蛋的原因已经很明确，有以下几个方面：第一，种禽的羽毛、粪便等污染了蛋壳；第二，胚蛋出现破蛋、裂纹蛋及薄壳蛋，这给绿脓杆菌的入侵提供条件；第三，种蛋在孵化过程中，对孵化室没有执行严格的消毒制度，很容易引起绿脓杆菌的污染，而造成种蛋的死亡，甚至引起弱雏出壳后死亡［2－8］。

3.4 对于预防绿脓杆菌污染胚蛋的措施，要做好以下两点：首先严格挑选种蛋并做好种蛋的消毒，从源头上杜绝该菌的污染；其次要严格执行孵化室的消毒制度。一旦发生绿脓杆菌感染胚蛋，要尽快使用敏感的药物对出壳后的幼雏进行补救性治疗，将损失降到最低。

［1］邢法禄.鸭铜绿假单胞杆菌的分离鉴定及药敏试验［J］.中国畜禽种业，2011，10：126－129.

［2］刘洋，郑家明，赵辉，等.鸡死胚中绿脓杆菌的分离和鉴定［J］.辽宁农业科学，2009（1）：14－17.

［3］贺海萍.鸡死胚中绿脓杆菌的分离与鉴定［J］.青海畜牧兽医杂志，2009，39（3）：14－15.

［4］卢中华，崔保安，路红丽，等.孵化厅内鸡胚与雏鸡的沙门氏菌与绿脓杆菌混合感染［J］.河南畜牧兽医，1997，18（3）：5－8.

［5］路振香，许大洋.绿脓杆菌致死鹅胚的初步研究［J］.畜牧与兽医，2005，37（5）：38－39.

［6］张桂枝，靳双星，李新正，等.初生雏鸡暴发绿脓杆菌病的诊治与原因分析［J］.养禽与禽病防治，2011（2）：35－36.

［7］何虎成，韩庆彦.雏鸡绿脓杆菌病诊治［J］.甘肃畜收兽医，1995，2：18－19.

［8］李翠蓉.初生雏鸭绿脓杆菌感染［J］.中国畜牧兽医，2010，37（12）：221－223.