一例水貂肺炎克雷伯氏菌与绿脓杆菌混合感染的确诊

陈超阳　和彦良　占才超

摘要：水貂肺炎是影响水貂养殖业发展的一种主要疾病，主要由于感染克雷伯氏和绿脓杆菌所致。本文以某一感染水貂肺炎的水貂养殖场为例，来阐述此病的实验室鉴定和预防措施。

关键词：水貂肺炎；克雷伯氏；绿脓杆菌；实验室鉴定；预防措施

山东省胶南地区某水貂养殖场所养水貂零散发生一种以败血症、高死亡率为症状的传染病，病貂的主要临床症状表现为精神沉郁、食欲废绝，1～2日内突然死亡，个别死亡水貂出现口鼻出血，剖检发现肺脏鲜红。采集病料，经实验室分离鉴定，确诊为肺炎克雷伯氏菌与绿脓杆菌混合感染。现将结果报道如下。

1材料与方法

1.1样品

患病死亡水貂肺脏，低温运至实验室，-20℃保存备用。

1.2主要试剂

TSA培养基、TSB培养基、细菌革兰氏染色试剂、绿脓杆菌生化鉴定试剂盒、克雷伯氏菌生化鉴定试剂盒、rTaq酶及D12000 Marker等。

1.3病源分离培养

取病料肺脏，无菌条件下用手术刀剪开新鲜切口，用接种环沾取切面后划线接种TSA平板，至37℃培养箱培养24～36h，观察培养结果。从培养的平板上挑取单菌落接种TSB培养基，进行纯化培养。

1.4涂片染色镜检

将纯培养的细菌涂片，经革兰氏染色，显微镜下观察菌体形态。

1.5生化试验

根据分离细菌的菌落形态和纯培养结果，分别用绿脓杆菌生化鉴定试剂盒和克雷伯氏菌生化鉴定试剂盒进行生化试验。

1.6PCR鉴定

取纯培养菌液以12，000r/min離心5min，弃上清，用注射用水溶解菌泥，煮沸5min后作为DNA模板。采用本实验室建立的绿脓杆菌和肺炎克雷伯氏菌的PCR方法进行鉴定。

1.7分离细菌的致病力试验

将分离到的两种细菌肉汤培养物分别腹腔注射小鼠，每种细菌培养物注射小鼠5只，0.2mL/只，同时设生理盐水对照小鼠5只，攻毒后观察7日，记录小鼠死亡情况。

2结果

2.1病原分离培养结果

划线TSA培养基培养24h后出现两种不同形态的菌落（见图1）。一种为扁平、边缘不整齐的黄绿色中大型菌落；一种为光滑隆起、乳白色的小型菌落，接种针挑取时可拉出丝。挑取两种单菌落分别接种TSB培养进行纯培养，接种中大型菌落的培养物呈淡绿色混浊状态，接种小型菌落的培养物呈浅褐色混浊状态。

2.2染色镜检结果

中大型菌落的细菌为单个存在或成双、呈短链排列的革兰氏阴性杆菌；小型菌落的细菌为单个存在或成双排列的革兰氏阴性短杆菌。

2.3生化鉴定结果

中大型菌落的纯培养物进行绿脓杆菌生化鉴定，结果符合绿脓杆菌生化特性（见表1）；小型菌落的纯培养物进行克雷伯氏菌生化鉴定，结果符合肺炎克雷伯氏菌生化特性（见表2）。

2.4PCR鉴定结果

中大型菌落的细菌PCR结果见图2，扩增出956bp的目的条带，与绿脓杆菌预期结果相符；小型菌落的细菌PCR结果见图3，扩增出428bp的目的条带，与克雷伯氏菌预期结果相符。

2.5致病力试验结果

攻毒7日后，腹腔注射生理盐水的对照小鼠健活，注射绿脓杆菌菌液和肺炎克雷伯氏菌菌液的小鼠均于48h内死亡，死亡小鼠剖检均出现肺脏出血（见图4）。

3小结与讨论

1）根据临床症状、剖检变化及病貂肺脏细菌的分离鉴定，确定水貂发病是由绿脓杆菌和肺炎克雷伯氏菌混合感染引起的。

2）近些年，由绿脓杆菌和肺炎克雷伯氏菌单独感染、或混合感染引起的水貂出血性肺炎越来越多，因两种细菌均为条件性致病菌，所以加强水貂养殖环境卫生，定期消毒，改善饲养条件和完善饲养管理，接种商品化疫苗，可以很大程度上预防由其引发的水貂肺炎。endprint