绵羊绦虫玻片标本的制作方法

马力克·艾则孜

（新疆维吾尔自治区动物卫生监督所，新疆 乌鲁木齐830063）

绵羊绦虫是一种长带状、有许多扁平节片体组成的蠕虫，寄生在绵羊的小肠上。分莫尼茨绦虫、曲子宫绦虫和无卵黄腺绦虫3种。寄生虫标本在寄生虫学的教学、科研、寄生虫病的诊断和防治工作中有十分重要的作用。将寄生虫制成玻片标本，可延长标本的保存时间，且可显示原始状态下难以观察的结构，是鉴别寄生虫虫种的重要手段与方法。根据寄生虫标本自身特性，一个永久性标本的制作过程包括固定、染色、脱水、透明和封片等5大步骤。但具体到不同虫种，其实际操作步骤亦有所不同。因此制作结构清晰、颜色鲜亮的绦虫染色标本是非常重要的。现以绵羊体内莫尼茨绦虫为研究对象，通过几种染色液染色效果的比较，参考一些相关的研究方法，经过多次摸索，对莫尼茨绦虫成虫制片方法进行了探索。

1 材料与方法

1.1 试验标本 于2011年4月至5月采自新疆克拉玛依市小拐牧场，伊犁哈萨克小羊，在小肠内采集莫尼茨绦虫。

1.2 试剂 卡红，苏木素精，酒精，浓盐酸，浓氨水，硼砂，铵明矾，甘油，甲醇，二甲苯，加拿大树胶等。

1.3 方法

1.3.1 染色液的配制方法 苏木素染液配制方法：将苏木素4g溶于95%酒精25mL中，再向其中加入400mL饱和铵明矾溶液。将此混合液暴露于日光及空气中3～7d，待其充分氧化成熟，再加入甘油100mL和甲醇100mL保存，待其颜色充分变暗，滤纸过滤，保存于棕色瓶中备用。

盐酸卡红染液配制方法：蒸馏水15mL加浓盐酸2mL，煮沸，趁热加入卡红染粉4g，再加入85%酒精95mL，滴加浓氨水中和，待出现沉淀为止，放冷，滤纸过滤，保存于棕色瓶中备用。

硼砂卡红染液配制方法：以4%硼砂溶液100 mL，加入卡红1g，加热溶解后，待冷，再加入70%酒精100mL，滤纸过滤，保存于棕色瓶中备用。

1.3.2 标本的采集和固定 莫尼茨绦虫是寄生于牛羊的小肠内，采集标本时应轻拉轻拽，切勿将虫体拽断，可将附着有虫体的肠段剪下，连同虫体浸入清水中，2～3h后，虫体会自行脱落。

压片固定 将采集的虫体剪成1.5cm左右的小段，压入两洁净的载玻片中间，为了不使虫体压的过薄，可在载玻片两端垫以适当厚度的纸片，用线绳扎紧载玻片两端，投入70%酒精中固定24～48h。

1.3.3 染色方法 （1）苏木素染色法：洗脱酒精后将压片固定好的虫体投入梯度酒精中，50%酒精（30min）→30%酒精（30min）→蒸馏水（10min）。染色：使用染色液的稀释倍数分别为10倍和15倍。两个不同浓度的染色液分别采用不同的染色时间：3 h，6h，12h，16h。脱水：将虫体从染液中取出，用蒸馏水洗去浮色，依次投入30%，50%，70%梯度酒精中，每级酒精脱水20min。分色：用盐酸酒精分色5～10min。盐酸酒精是80%酒精100mL加入2mL浓盐酸。脱水：依次投入80%，90%，95%，100%Ⅰ，100% Ⅱ梯度酒精中，每级酒精20min。透明：将虫体移入100%二甲苯中透明1～2min。封固：用加拿大树胶封固。（2）盐酸卡红和硼砂卡红染色法：将压片固定好的虫体直接投入染色液中染色，染色时间为：3h，6h，12h，16h。用盐酸酒精分色5～10min。依次投入80%，90% ，95%，100% Ⅰ，100% Ⅱ梯度酒精中，每级酒精20min。将虫体移入100%二甲苯中透明1～2min。用加拿大树胶封固。

2 结果与分析

采用3种不同的染色液、不同的染色液浓度和染色时间，并摸索了脱水、分色和透明的时间，对制作的莫尼茨绦虫成虫染色标本的染色效果进行了比较（见表1）。

比较结果表明，用苏木素染色液所得染色标本结构清晰，效果最好；其中1∶15苏木素染液染色的成节中，卵巢、卵黄腺、睾丸、节间腺、纵排泄管等器官着色均匀，结构清晰，对比鲜明。孕卵节片中子宫、虫卵、节间腺等结构也很清晰。最佳的染色程序为：70%酒精压片固定24～48h→50%酒精（30 min）→30%酒精（30min）→蒸馏水（10min）→苏木素染色液1∶15稀释液（12h）→用蒸馏水洗去浮色→30%酒精（20min）→50%酒精（20min）→70%酒精（20min）→盐酸酒精（5～10min）→80%酒精（20min）→90%酒精（20min）→95%酒精（20 min）→100%酒精Ⅰ（10min）→100%酒精Ⅱ（10 min）→二甲苯（1～2min）→加拿大树胶封固。用盐酸卡红染色液和硼砂卡红染色液染制的标本虫体内部各器官和其他组织均呈亮红色，对比性差，结构分辨不清楚。

表1 不同浓度染液和染色时间对莫尼茨绦虫成虫的染色效果比较

3 结论

绦虫的染色方法有多种，但苏木素染色液是组织化学和免疫组织化学中最常用的染料之一，但不能直接用来染色，必须暴露在空气中变成氧化苏木精（苏木素）后才能使用。苏木素在空气中暴露一般为3～7d后即可使用，配制后时间愈久，着色力愈强。试验也显示，用苏木素染色法制作绦虫成虫染色标本，同样可收到好的效果。用此方法制作的莫尼茨绦虫成节中雌雄生殖系统、排泄系统、节间腺结构清晰，孕节中子宫和虫卵的结构也较容易辨认。苏木素染色法操作比较简单，其关键点是染色、分色、脱水和透明的时间。染色时间宜长不宜短；分色要恰到好处，颜色不能过重也不能过浅；脱水要充分，在高浓度酒精中时间不能太长，高浓度酒精很容易使染好的标本变脆；透明时间1～2min即可，时间太长染出的标本会变得很脆，不宜封片。苏木素染色液性能稳定，重复使用效果也很好，陈旧的苏木素染色液可经过滤等方法去除染色液中的沉渣后仍可使用。因此，采用苏木素染色法，不但提高了莫尼茨绦虫成节的染色效果，对其他种类绦虫成节标本的染色效果提高也可能有一定参考意义。

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