乌桕梓油中四酯的分离及鉴定

尹立军 陆向红 卢美贞 薛 蓉 窦 晓 计建炳

乌桕梓油中四酯的分离及鉴定

尹立军 陆向红 卢美贞 薛 蓉 窦 晓 计建炳

(浙江省生物质燃料利用技术研究重点实验室浙江工业大学化学工程与材料学院，杭州 310014)

乌桕梓油中含有一种特殊结构的四酯成分。利用柱层析技术对乌桕梓油中的四酯进行分离。采用紫外分光光度法(UV)、气相色谱(GC)、气相色谱－质谱联用(GC－MS)和高效液相色谱(HPLC)对分离样品进行分析。结果表明，柱层析适宜的分离条件为:硅胶为吸附剂，95%石油醚和乙酸乙酯的混合溶液为洗脱剂，洗脱剂流速为1 mL/min，硅胶用量为17 g/g梓油。在此条件下可以得到纯度为98%的梓油四酯产品，其收率为54．8%。

四酯 梓油 柱层析

乌桕为大戟科乌桕属植物，是我国特有的木本油料树种，分布在长江流域以南地区，具有生长快、籽出油率高(40%～50%)的特点［1］，被我国列为四大木本油料作物之一，其籽油可用于制取生物柴油［2］。

乌桕籽果仁榨取的油脂称为梓油。梓油具有旋光性，分析梓油甘油酯的脂肪酸组成发现，梓油甘油酯中含有2，4癸二烯酸［3－5］，进一步分析发现梓油中含有一种普通植物油没有的、结构特殊的四酯［6］(梓油四酯，estolide)，梓油四酯的分子结构式见图1。该四酯在梓油中的质量分数为30%左右。梓油四酯分子含有两种结构特殊的中长链脂肪酸8－羟基5，6辛二烯酸和2，4癸二烯酸，这两种烯酸含有多种官能团，性能活泼，具有潜在的应用价值和研究意义。

图1 梓油四酯的分子结构

本试验对柱层析技术从乌桕梓油中分离甘油四酯进行研究，采用紫外分光光度法(UV)、气相色谱(GC)、气相色谱－质谱联用(GC－MS)和高效液相色谱(HPLC)对分离样品进行定性和定量检测。探索柱层析技术从梓油中分离梓油四酯的最佳分离条件。

1 材料与方法

1．1 仪器与试剂

乌桕梓油:湖北省大悟县;柱层析硅胶:200～300目，青岛海洋化工厂;石油醚:60～90℃，AR，北京长海化工厂;乙酸乙酯:AR，国药集团化学试剂有限公司;乙醇:AR，浙江衢州巨化有限公司。

Agilent 7890A气相色谱仪:美国安捷伦公司;Carry 50紫外 －可见分光光度计、Prostar 210高效液相色谱仪:美国瓦里安技术公司;层析柱:Φ13 mm×18 cm，自制;薄层色谱硅胶板:(Φ25 mm×75 mm)，青岛海洋化工厂。

1．2 试验方法

1．2．1 乌桕梓油成分分析

梓油四酯因分子中含有2，4－癸二烯酸基团，故在260 nm处具有紫外特征吸收［7］。

通过测定乌桕梓油的紫外光谱图以及乌桕梓油的脂肪酸组成来判断所购乌桕梓油中是否含有梓油四酯。

1．2．1．1 乌桕梓油紫外光谱图的测定

称取乌桕梓油17．5 mg，用乙醇溶解，配制成0．175 mg/mL的溶液，样品溶液在200～800 nm之间扫描，得到乌桕梓油的紫外光谱图。

1．2．1．2 乌桕梓油脂肪酸组成的测定

乌桕梓油的甲酯化:称取100 g乌桕梓油，30 g甲醇和1 g KOH，在恒温水浴中加热并恒温在60℃，500 r/mim下搅拌反应1 h。反应结束后静置分层取上层油相。上层油相经酸洗、水洗、脱水后，取样进行GC－MS分析。

GC－MS分析条件:色谱条件:HP石英毛细管色谱柱(30 m×0．32 mm×0．50μm);载气为高纯氮气(99．999%)，不分流进样;程序升温:初始温度80℃，以10℃/min升至260℃，维持10 min。质谱条件:电子轰击(EI)离子源，EI电子能量70 eV，离子源温度150℃，GC－MS传输线温度250℃，质量扫描范围m/z 40～650。

1．2．2 乌桕梓油中四酯含量测定

1．2．2．1 薄层层析定性测定乌桕四酯

乌桕梓油用石油醚溶解后，点样于活化后的硅胶板底端，以石油醚∶乙酸乙酯=90∶10为展开剂，展开后的硅胶板在254 nm的紫外灯下观察，标示出荧光点后，将硅胶板放入碘量瓶中显色，结果见图2。乌桕梓油在硅胶板上呈现3个点，中间点在250 nm紫外灯下有荧光，初步确定为梓油四酯［8］。

图2 乌桕梓油的TLC分析结果

1．2．2．2 HPLC定量测定乌桕四酯

色谱条件:色谱柱C18柱kromasil C18(250 mm×4．6 mm);检测波长:260 nm;流动相:乙腈∶异丙醇∶正己烷=80．5∶10∶9．5;流速:1 mL/min;柱温30℃。

HPLC测定乌桕四酯标准曲线:称取四酯标样0．135 1 g溶于正己烷中，定量至10 mL，配成标准溶液。每次进样量分别为5、10、15、20μL。将每次得到的HPLC图峰面积之和与进样的四酯质量作图，并拟合获得标准曲线。

样品中四酯含量的确定:分别称取0．242 2 g梓油、0．143 6 g脱除四酯后的梓油、0．135 1 g梓油四酯溶于正己烷中，定量至25 mL，配成样品溶液。样品进行HPLC分析，并通过标准曲线计算样品中四酯的含量。

1．2．3 分离方法

1．2．3．1 洗脱液的确定

乌桕梓油用石油醚溶解后，点样于活化后的硅胶板底端，分别在含石油醚50%、60%、70%、80%、90%、95%的石油醚与乙酸乙酯的混合溶液中展开。展开后的硅胶板置于碘量瓶中显色。梓油在硅胶板上的条带显示，石油醚∶乙醚=95∶5的分离效果最好。故以石油醚∶乙醚=95∶5作为硅胶柱层析分离四酯的洗脱剂。

1．2．3．2 吸附剂的选择

分别采用酸性氧化铝和硅胶为吸附剂，用石油醚体积分数为95%的石油醚与乙酸乙酯作为洗脱液，进行柱层析分离四酯的试验。

1．2．3．3 柱层析法从乌桕梓油中分离乌桕四酯

将层析硅胶在105℃下活化2 h。在层析柱的底部放一石英棉，用石油醚湿法装柱15 cm高(内径13 mm)，取0．606 0 g乌桕梓油，加2 mL石油醚溶解，缓缓倒入硅胶层析柱中，以石油醚和乙酸乙酯=95∶5作为洗脱剂进行洗脱，每5 mL收集一个馏分，得到24个馏分，用可见－紫外分光光度计检测追踪各洗脱组分的吸光度。组分浓度较大时，可进行一定倍数的稀释，重点收集在吸光度为260 nm有较大吸收时的组分，收集的馏分脱除溶剂后得到四酯样品。

2 结果与讨论

2．1 乌桕梓油组分的确定

乌桕梓油的紫外－可见光光谱图见图3。

图3 乌桕梓油的紫外－可见光光谱图

从图3可见，乌桕梓油在260 nm有特征吸收，这是由梓油四酯分子中2，4癸二烯酸基团的共轭双键引起的，与文献［7］相符。说明所用的梓油原料中含有梓油四酯。

2．2 乌桕梓油甲酯的GC－MS分析结果

乌桕梓油甲酯化产物经GC－MS分析，其结果见图4和表1。图4为质子离子流图，表1为相应出峰时间的MS分析结果。

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梓油紫外光谱图和梓油脂肪酸组成结构显示本试验所用的乌桕梓油中含有梓油四酯。

2．3 乌桕梓油中乌桕四酯含量的确定

以各梓油四酯的峰面积之和为横坐标，进样量为纵坐标作图，通过线性拟合，得到HPLC分析乌桕梓油四酯的标准曲线方程为Y=16．342X，式中:Y为四酯的进样量/μg，X为对应的四酯峰面积之和。乌桕梓油四酯在67．55～270．2μg范围内呈现良好的线性关系，相关系数为0．999 9。

HPLC测得梓油中甘油四酯的质量分数为41．7%。

2．4 HPLC分析结果

图5给出了紫外吸收波长260 nm处的梓油、梓油三酯、梓油四酯的HPLC色谱图。该图中的梓油三酯和梓油四酯分别是由梓油通过柱层析获得的两个产品(对应于2．5部分的产品1和产品2)。图5显示，梓油和梓油四酯在260 nm下显示有色谱峰，而梓油三酯却没有，这说明组成梓油和梓油四酯的脂肪酸中含有2，4－癸二烯酸。四酯产品出现多个HPLC色谱峰是因为梓油中的四酯不是单一成分，主要由OLnE、PLnE、OLE、PLE等具有不同脂肪酸组成的四酯组成。

图5 梓油、三酯、四酯的HPLC图

2．5 柱层析从乌桕梓油中分离四酯的结果

2．5．1 流出曲线

将硅胶柱层析试验所得各馏分进行UV跟踪分析，在波长210、260 nm下进行吸光度测量，以吸光度对各馏分对应的洗脱体积作图，得到硅胶柱层析分离梓油四酯的洗脱曲线，如图6。

图6显示:在洗脱体积0～35 mL时，洗脱液在210 nm下有较大吸收，而在260 nm下吸光度很小，说明该洗脱部分不含梓油四酯，因该洗脱部分的极性比四酯极性低，故推测为梓油三酯;在洗脱体积35～95 mL时，洗脱液在210 nm和260 nm下都有较大吸收，说明该洗脱部分含有梓油四酯。洗脱体积大于95 mL，260 nm处的吸光度逐渐下降，而210 nm处仍有较大吸收，说明梓油中含有极性高于四酯的其他成分。

图6 硅胶柱层析分离梓油四酯的洗脱曲线

2．5．2 馏分的TLC结果

分别合并0～35 mL，35～95 mL和95 mL以后的洗脱液，脱除溶剂，得到产品1、2、3。

产品1，2，3用薄层层析分析组成，结果见图7。

图7 柱层析分离梓油四酯各产品的TLC图谱

图7显示，产品1主要是梓油三酯，产品2主要是梓油四酯，产品3是极性比四酯高的成分和四酯的混合物。

2．5．3 HPLC分析结果

经HPLC分析，柱层析得到的产品2中四酯含量为98%，同时计算得到四酯的收率为54．8%。

2．6 吸附剂种类对柱层析法从梓油中分离甘油四酯效果的影响

分别探讨了硅胶和活性氧化铝作为吸附剂对柱层析法分离甘油四酯的效果的影响，将硅胶和活性氧化铝作为吸附剂，柱层析后得到的馏出液进行TLC分析，图8为分析结果。

图8 活性氧化铝和硅胶作为吸附剂得到的产品的TLC图谱

用活性氧化铝作为吸附剂，获得的各个馏分差异很小，基本上均含有梓油三酯和梓油四酯，三酯和四酯的分离效果很差。而硅胶作吸附剂获得的前馏分主要含有梓油三酯，中间馏分主要是梓油四酯，后馏分是极性比四酯大的其他物质。硅胶作为吸附剂，梓油四酯可以和三酯及其他物质分开，分离度较高，可以得到纯度为98%的四酯产品。

乌桕梓油中甘油三酯和甘油四酯都具有不饱和双键，硅胶是由于表面结构中的硅羟基(—Si—OH)通过硅原子上的—OH与梓油中不饱和化合物形成氢键，但硅胶的吸附性能小于活性氧化铝。在柱层析过程中选用吸附性能较小的硅胶吸附剂去分离中性的乌桕梓油的中的梓油四酯效果好于活性氧化铝。

3 结论

3．1 乌桕梓油中含有41．7%四酯。

3．2 以硅胶为吸附剂，通过柱层析分离，得到收率为54．8%纯度为98%的甘油四酯。

3．3 甘油四酯是一类结构特殊的甘油酯类物质，其分子中含有的8－羟基5，6－辛二烯酸和2，4癸二烯酸性质活泼，是具有应用前景的化工原料。从乌桕梓油中分离梓油四酯，有利于甘油四酯的应用开发。

［1］张克迪．乌桕油的开发利用［J］．生命世界，1986(6):7

［2］刘火安，姚波．乌桕油脂成分作为生物柴油原料的研究进展［J］．基因组学与应用生物学，2010，29(3):402－408

［3］Ya －Chi Chen，A Zlatkis，B SMiddleditch，et al．Scheld．Lipids of Contemporary Stillingia Oil［J］．Chromatographia，1987，23(4):240－242

［4］廖学焜，李宝灵，陆碧瑶，等．乌桕梓油和桕脂的脂肪酸组成研究［J］．热带亚热带植物学报，1993，1(1):86－89

［5］Kathleen Payne－Wahl，Robert Kleiman．Quantitation of Estolide Triglycerides in Sapium Seeds by High Performance Liquid Chromatography with Infrared Detection［J］．Journal of the American Oil Chemists，1983，60(5):1011－1012

［6］HowardW Sprecher，Rene Maier，M Barber，et al．Holman．Structure of an Optically Active Allene－containing Tetraester Triglyceride Isolated from the Seed Oil of Sapium sebiferum［J］．Biochemistry，1965，4(9):1856－1863

［7］K Aitzetmulle，忻耀年，G．Werner，et al．乌桕油的高效液相色谱研究［J］．中国粮油学报，1996，11(6):36－43

［8］忻耀年．梓油中光学活性甘油酯的研究［J］．郑州粮食学院学报，1993(1):74－80．

Separation and Identification of Tetracylglycerols from Stillingia Oil

Yin Lijun Lu Xianghong Lu Meizhen Xue Rong Dou Xiao Ji Jianbing
(Zhejiang Province Key Laboratory of Biofuel College of Chemical Engineering and Materials Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014)

Stillingia oil are extracted from the seeds of Sapoum sebifrrum Roxb．It contains a special structure of tetracylglycerols．Tetracylglycerols in stillingia oil is isolated using column chromatography．The UV spectrometry，Gas Chromatography(GC)，Gas Chromatography－Mass Spectrometry(GC－MS)and high performance liquid chromatography(HPLC)are used to analyze the separated samples．The result shows that the column chromatography is preferably conducted under such conditions:Silica gel as adsorbent，95%of petroleum ether and 5%ethyl acetate mixtures as eluent，flow rate of 1ml/min，m(stillingia oil):m(silica)=1∶17．The purity of 98%of stillingia oil samples is obtained and the yield is 54．8%under this condition．

tetracyglycerols，stillingia oil，column chromatography

TQ646．4

A

1003－0174(2012)08－0052－05

浙江省重大科技专项(2006C11015)

2011－11－03

尹立军，男，1988年出生，硕士，化学工程

陆向红，女，1971年出生，副教授，硕士研究生导师，化学工程