植物油中甾醇组成及总量测定方法的改进

朱 琳 张 蕊 薛雅琳 马 榕

植物油中甾醇组成及总量测定方法的改进

朱 琳 张 蕊 薛雅琳 马 榕

(国家粮食局科学研究院，北京 100037)

在2个国际标准方法ISO 12228和COI/T．20/Doc．no．10的基础上，对植物油中甾醇组成及总量的检测方法进行了改进，并将改进方法与2个国际标准方法进行了比较。结果表明:在测定植物油中甾醇组成及总量时，选用5α－胆甾烷基－3β－醇作为内标，氧化铝柱提取不皂化物，99%双三甲基硅基三氟乙酰胺+1%三甲基氯硅烷和等体积的无水嘧啶作为衍生剂以及采用恒温气相检测条件不仅提高了检测速度，还降低了操作难度及操作成本。同时，使用改进后的方法对10个不同的植物油样进行了重复性验证，结果重复性均在国际标准方法要求范围之内。

植物油 甾醇组成 甾醇总量 检测 改进 气相色谱法

植物甾醇是以环戊烷多氢菲(又称甾核)为骨架的一类甾体化合物，如图1所示。随着C17及R所含双键数目的多少和位置的差异，该分子结构代表了不同种类的植物甾醇［1－2］。多数甾醇的C－5位为双键，C－3位为羟基是重要的活性基团之一，甾醇通过它形成各种衍生物，甾醇的这种结构特点决定了它多方面的生理特性，它具有降胆固醇、抗肿瘤等生理功能［3］。植物油中含有丰富的植物甾醇，是人体摄入植物甾醇的重要来源，对于不同种类的植物油其甾醇组成及总量不同，而对于同一种类的植物油，甾醇组成及总量又是相对固定的，因此甾醇组成及总量也可以作为植物油的特征指纹，是检测油品是否掺伪的重要指标之一［4］。鉴于测定甾醇组成及总量有如此重要的作用，建立一个方便快捷的方法是很有必要的。

图1 环戊烷多氢菲(又称甾核)

目前分析测定植物甾醇的方法较多。早期有毛地黄皂甙法、比色法、酶法等，但这些方法只能测定甾醇总量，不能有效分离甾醇组分并定量。有文献报道化学法、薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)和气相色谱法(GC)等，其中气相色谱法分离效果好、分析速度快、灵敏度高、操作简便，已被国际、国内标准采用［5］。本试验在测定植物油中甾醇组成及总量的两项国际标准方法(ISO和COI)的基础上，对内标的选择、不皂化物的提取方式、甾醇衍生化以及色谱条件等方面进行了优化，使得改进后的方法降低了检测成本并易被分析技术人员所掌握。

1 材料与方法

1．1 试验材料

食用油样品:市售，玉米油3个，添加甾醇酯的玉米油、花生油各2个，米糠油、橄榄油、葵花籽油各1个。

1．2 试剂

内标及衍生剂:alfa公司和sigma公司;100～200目中性氧化铝:上海五四化学试剂有限公司;20 cm×20 cm硅胶薄层板，厚度0．25 mm:青岛海洋化工厂;2，7－二氯荧光黄:北化恒业。

1．3 仪器

7890A气相色谱仪(FID检测器):安捷伦(Agilent)公司;紫外灯(波长254 nm):瑞士卡玛(CAMAG)公司;旋转蒸发仪:瑞士步琪(Buchi)公司。

1．4 方法

方法1:COI/T．20/Doc．no．10/Rev．1气相色谱法测定甾醇组成及甾醇含量［6］。

方法2:ISO12228:2008动植物油脂甾醇组成和甾醇总量的测定气相色谱法［7］。

具体操作步骤见表1。

表1 3种甾醇组成及总量检测方法

表2 3种方法对不同油样分析测定结果

2 结果与讨论

2．1 样品色谱分析

同一样品采用3种不同方法得到的典型色谱图，见图2～图4，3种不同方法各甾醇组分均得到了较好的分离。

图3 方法2提取甾醇的气相色谱图

2．2 3种方法分析结果比对

图4 改进方法提取甾醇的气相色谱图

对玉米油1#样、添加甾醇酯的玉米油1#样、米糠油1#样进行了甾醇组成及总量的分析测定，3种测定方法的结果与数据见表2。可以看出，采用改进方法与方法1、方法2测得的甾醇组成及总量的结果并无明显差异。但由于方法1、改进方法选择的内标是5α－胆甾烷基－3β－醇，使得色谱分析时内标物与胆固(甾)醇的保留时间较接近，得到的胆甾醇含量会略高于方法2的分析结果。

2．3 采用改进方法测定不同品种植物油的重复性

由表3数据可以看出，改进方法分析样品的甾醇总量在1 441～18 240 mg/kg之间，其重复性在9．15～176．62之间，符合方法二甾醇总量约为2 000～8 000 mg/kg范围时，重复性应在186．90～489．00之内的要求。因此，证实改进的方法重复性良好，满足植物油甾醇定量分析要求。

表3 改进方法对不同油样分析测定结果

表4 3种测定方法的优缺点比较表

2．4 讨论

对2种测定方法的优缺点进行了详细的比较，详见表4。

从表4可以看出:改进方法是在方法1、方法2的基础上，通过整合了各分析步骤的优点而形成的。

在选择内标时，方法2添加1 mL 1．0 mg/mL的内标，内标的峰面积比例偏大，从而影响低含量甾醇组分的测定结果。改进的方法首先考虑到植物油甾醇总量在100～22 100 mg/kg范围内变化［8］，根据甾醇总量的不同，合理的选择内标添加量。从成本方面看，改进方法内标5α－胆甾烷基－3β－醇(即胆甾烷醇)价格约为40元/g，而方法2桦木醇价格约1 500元/g。

在提取不皂化物时，改进方法采用氧化铝柱来提取，不仅节省了乙醚的用量，也提高分析速度。而方法1提取不皂化物需要耗用大量的乙醚，易出现乳化现象且费时。

在选择甾醇的薄层喷显剂时，改进的方法选用碱板，2，7－二氯荧光黄的乙醇溶液喷淋，剂量易控制、显色持久，条带边界清晰，也减少了操作过程可能对实验者的身体伤害，且易于操作。而方法2使用甲醇溶液喷淋时，剂量难以控制、显现时间短，二次喷淋易造成边界不清晰，甲醇挥发易致人中毒。

在选择硅烷化试剂时，改进的方法选择BSTFA+TMCS(99∶1)和同比例的无水嘧啶作为硅烷化试剂，衍生只需要在室温下完成，10 mL玻璃试管即可作为反应瓶，试剂成本降低了十几倍。而方法2所用的衍生剂需在高温下进行，且需耐温、密闭性好的反应瓶。

改进方法分析速度快，50 min即可，且峰分离度满足要求，而方法2的色谱分析时间超过了70 min。

3 结论

通过3种方法分析步骤的对比可以看出，改进的方法具有以下优点:选择的内标与添加量合理且成本较低;不皂化物提取省时、省试剂;选用的薄层喷显剂显色持久，条带边界清晰;甾醇衍生化试剂成本低廉，操作简便;缩短了气相色谱分析的时间。

通过3种方法分析不同样品结果的比较以及对改进方法重复性的验证，结果表明，改进的方法不仅快速稳定，重复性满足定量分析要求，且适用各种植物油中不同甾醇组成及总量的分析。

［1］杨振强，谢文磊，李海涛，等．植物甾醇的开发与应用研究进展［J］．粮油加工与食品机械，2006(1):53－56

［2］曹莹，谷克仁，孟冬，等．植物甾醇提取方法研究进展［J］．粮油食品科技，2006，14(5):25－28

［3］彭莺，刘福祯，高欣．天然植物甾醇的应用与提取工艺［J］．化工进展，2002，21(1):49－53

［4］张蕊，薛雅琳，朱琳，等．橄榄油中甾醇组成及总量测定方法的探讨［J］．中国油脂，2011，36(8):77－80

［5］冯妹元，韩军花，刘成梅，等．常见精练油中植物甾醇测定方法的建立及含量分析［J］．中国食品卫生杂志，2006，18(3):197－201

［6］COI/T．20/doc．no．10/rev．1－2001，Determination of the composition and content of sterols by capillary－column gas chromatography［S］

［7］ISO12228—1999，Animal and vegetable fats and oils－determination of individual and total sterols contents－gas chromatographic method［S］

［8］Codex－stan 210—1999，Codex standard for named vegetable oils［S］．

Improvement of the Measuring Methods of Composition and Total Contents of Sterols in Vegetable Oils

Zhu Lin Zhang Rui Xue Yalin Ma Rong
(Science Academy of State Grain Administration，Beijing 100037)

The determination of composition and total contents of sterols in vegetable oils is improved on the basis of the two international standard methods(ISO and COI)．The improvement method is compared with two international standard methods．The optimum conditions are obtained as follows:5α－cholestan－3β－ol as internal standard，aluminium oxide column，99%bistrimethylsilyl trifluor acetamide+1%trimethyl chlorosilane and an equal volume of anhydrous pyridine as silanization reagent，and the constant temperature gas phase detection conditions．The results indicate that the method is rapid，simple and cost saving．Meanwhile，the repeatability of the improved method is verified by detecting ten vegetable oil samples．It is in the range of international standard method required．

vegetable oils，composition of sterol，total contents of sterol，inspection，improvement，gas chromatography

TQ646

A

1003－0174(2012)08－0109－05

2011－11－08

朱琳，女，1984年出生，生物工程

薛雅琳，女，1960年出生，教授级高级工程师，粮油品质及标准