吉林省双阳梅花鹿鹿茸蛋白组分的细胞毒性实验研究

吴 荻，魏征人，陈智嘉，刘玉侠，宋光子，高宇航，赵大玮

（1.吉林省肿瘤医院 肿瘤内科，吉林 长春130012；2.吉林大学白求恩医学院 药理学教研室，吉林 长春130021；3.吉林省肿瘤防治研究所，吉林 长春130012）

鹿茸（Cornu Cervi Pantotrichum）为梅花鹿（Cervus nippon）或马鹿（cervus elaphus）的雄鹿末骨化密生绒毛的幼角，为我国名贵的传统中药材，鹿茸蛋白（pilose antler protein，PAP）是从鹿茸中提取的一类具多种生理活性的物质，占鹿茸总质量的52%以上［1－3］，近年来一系列相关的研究发现鹿茸蛋白具有免疫调节、抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗疲劳、治疗神经损伤等多种生物学效应［4，5］，有广泛的应用前景和巨大的药用价值［6］。为进一步研究鹿茸蛋白可能存在的抗肿瘤活性，本课题组特选人肝癌SMMC－7721细胞及人肺腺上皮SPC－A－1细胞进行细胞毒性实验研究，为鹿茸蛋白的抗肿瘤应用及其作用机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与主要仪器 双阳梅花鹿鹿茸购自吉林双阳梅花鹿养殖基地；超滤离心管（Millipore公司，美国）；透析袋（北京华美生科生物技术有限公司）；SMMC－7721细胞、人肺腺上皮 SPC－A－1细胞（吉林省肿瘤防治研究所保存并提供）；测定蛋白浓度的Folin－酚试剂盒和刀豆蛋白A（Con A）（长春鼎国公司）；5－氟尿嘧啶（5－FU）和顺铂 （DDP）（云南个旧生物制药有限公司，批号：101203）；其余试剂皆为国产分析纯试剂；酶标仪 （Lab Systerm Dragon.Multiskan MK3）。

1.2 鹿茸蛋白组分的提取 称取新鲜梅花鹿鹿茸900g，横向切成厚度约为3mm圆形薄片，用超纯水冲洗至无血色为止。加入0.01MPBS溶液1 500 ml，用高速组织匀浆机粉碎匀浆，再将匀浆液在4℃条件下，以8 000rpm／min离心15min，取上清液，用截留分子量8000的透析袋以超纯水透析，每12h换一次透析液，36h后，将透析袋内液体取出，用截留分子量30 000和10 000的超滤离心管进行分子量截留，4℃条件下，以8 000rpm／min离心15min，离心后，分别取超滤膜两侧的液体，获取3种不同分子量的鹿茸蛋白组分，0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。然后用Folin－酚试剂法测蛋白浓度，用5倍倍比稀释法构成5个相关浓度的稀释液，保存在－70℃中待用。

1.3 鹿茸蛋白组分的细胞毒性实验

1.3.1 细胞培养 SMMC－7721细胞及人肺腺上皮SPC－A－1细胞培养于IMDM培养基（10%胎牛血清，5%二氧化碳，37℃），常规复苏后培养5天后，第一次传代，以后每3天传代一次，取长至对数生长期的细胞计数后种板，进行后续实验。

1.3.2 MTT检测 取对数生长期细胞消化，制备5×104／ml细胞悬液，接种于96孔板 ，每孔加细胞悬液180μl。培养24h后，进行实验分组及加样（不同分子量蛋白组分样品按5倍浓度做倍比稀释，各浓度做4复孔），用5－FU（25，50，100μg／ml）和DDP（10，20，40μg／ml）做阳性对照。然后进行孵育24h后的MTT检测。每孔加20μl MTT，继续培养4h。弃去上清液，加 DMSO 200μl／孔，震荡器上震荡使充分溶解。在酶标仪490nm波长处读取A值，求出平均值，抑制率（IR）＝（1－实验组A值／对照组A值）×100%。IR＜30%为不敏感，IR≥30%为低度敏感，IR≥50%为中度敏感，IR≥70%为高度敏感［8］。

1.4 鹿茸蛋白组分的淋巴细胞转化实验

将昆明小鼠分为：鹿茸蛋白高，中，低3浓度组（鹿茸蛋白原浓度的1／2，1／4，1／8）；胸腺肽阳性对照组（浓度1mg／ml）；生理盐水阴性对照组；给药剂量0.01ml／g。经皮下注射14天后，每组各取5只断颈处死后，经75%乙醇消毒后，放置超净台中。

无菌取出脾脏，将其裹入2层无菌纱布中，放置35mm细胞培养皿中，用弯头镊子轻轻挤压脾脏，将脾细胞游离出来。用2ml的RPMI1640培养基（含10%小牛血清）稀释成脾细胞悬液。缓慢的滴入2ml淋巴细胞分离液的上方。2 000rpm 20 min，离心后，清晰可见细胞分层（共4层）。用吸管轻轻吸出乳白色层（第二层）。置入1.5ml无菌EP管中，2 000rpm，5min。弃去上清液，加入1ml的D－hanks液。2 000rpm，5min（洗3次），弃洗液，加入RPMI1640培养基（含10%小牛血清）。每组管取0.02ml加到细胞计数板上，并调至细胞终浓度约为2×106。将10%小牛血清的培养基（含ConA0.005mg／ml）加入96孔无菌细胞板中，每孔0.05ml，再加入脾细胞悬液0.05ml（每组设三个复孔），并设置培养基（不含脾细胞悬液）的空白对照孔。培养板置于CO2培养箱中（37°5%CO2）培养72h。

培养终止前2h。取出培养板，每孔依次加入MTT（5mg／ml）0.01ml。加完后轻轻搕板，使之与细胞充分混匀，继续培养4h。弃去上清液，并加入DMSO 0.1ml。将颗粒溶解，并终止培养。通过酶标仪570nm检测OD值。将实验组和对照组的三复孔OD值平均，转化值＝实验组平均OD值－阴性对照组平均OD值。

1.3.3 统计学分析 数据采用统计软件SPSS13.0处理。5－FU、顺铂及鹿茸多肽蛋白对于肿瘤细胞的抑制率数值比较采用t检验。

2 结果

2.1 鹿茸各蛋白组分的浓度测定 根据标准曲线得公式y＝0.0082x＋0.3066，Folin－酚试剂盒测得各蛋白组分的浓度值如下：分子量＜10kD：A：0.347，蛋白浓度：4.93μg／ml；分子量＞10kD＜30 kD：A：0.335，蛋白浓度：3.46μg／ml；分子量＞30kD：A：0.483，蛋白浓度：21.51μg／ml。因蛋白浓度测前已稀释20倍，故分子量＜10kD蛋白组分的原浓度为98.6μg／ml，倍比稀释浓度由高到低依次为19.72μg／ml，3.94μg／ml，0.79μg／ml，0.16μg／ml。分子量＞10kD＜30kD蛋白组分的原浓度为69.20μg／ml，倍比稀释浓度依次为13.84μg／ml，2.77μg／ml，0.55μg／ml，0.11μg／ml。分子量＞30 kD蛋白组分的原浓度为430.20μg／ml，倍比稀释浓度依次为86.04μg／ml，17.21μg／ml，3.44μg／ml，0.69μg／ml。

2.2 鹿茸各蛋白组分的细胞毒性实验结果 鹿茸各蛋白组分针对SPC－A－1细胞的 MTT实验结果，经计算得出的细胞生长抑制率见表1。从表1中，SPC－A－1细胞对鹿茸各组分蛋白不敏感，呈现“耐药”现象，和阳性对照组相比有明显的差异（P＜0.05）。

表1 鹿茸各蛋白组分针对SPC－A－1的细胞生长抑制率（%）

鹿茸各蛋白组分针对SMMC－7221细胞的MTT实验结果，经计算得出的细胞生长抑制率见表2。从表2中，分子量＜10kD，＞30kD，10～30 kD的鹿茸蛋白组分中，高剂量组的抑制率均大于30%，呈现“低度敏感”；分子量＜10kD，10～30kD的鹿茸蛋白组分中，中高剂量组的抑制率大于30%，呈现“低度敏感”。而且呈现剂量依赖性关系。

表2 鹿茸各蛋白组分针对SMMC－7221的细胞生长抑制率（%）

2.3 鹿茸蛋白组分的淋巴细胞转化实验结果 鹿茸蛋白组分高、中、低剂量组的平均OD值分别为为0.46±0.05、0.29±0.03和0.17±0.03；胸腺肽阳性对照组的平均OD值为0.47±0.07；生理盐水阴性对照组的平均OD值为0.12±0.04。鹿茸蛋白组分高、中、低剂量组的转化值分别为0.34、0.17和0.05；胸腺肽阳性对照组的转化值为0.35。鹿茸蛋白组分的高中剂量组和胸腺肽对照组与阴性对照组OD值比较，差异具有显著性（P＜0.05）；鹿茸蛋白组分的高剂量组和胸腺肽对照组OD值比较，差异不具有显著性（P＞0.05）。

3 讨论

吉林省长春市双阳区有300多年养鹿历史，此地区养殖的梅花鹿是我国特有的梅花鹿品种，而鹿茸蛋白具有促生长、抗氧化、提高免疫力、抗肿瘤等多种生物学活性。本实验采用了超滤离心法是目前很流行的一种根据分子量不同的蛋白质组分分离方法［9］，其具有分离速度快，操作简便，获取的分子量范围比较准确、不丧失蛋白活性、具有浓缩效应等诸多优点，便于今后鹿茸蛋白组分的分级分离中大规模应用。

本课题组曾就鹿茸蛋白应用安全性问题进行过初步的研究［10］，发现鹿茸总蛋白经过口服、皮下、腹腔注射等给药途径，对小鼠组织器官有一定的病理性损伤，但不知这种损伤是否和其细胞毒性有关。进一步实验采用了MTT法，旨在探讨鹿茸蛋白对于所选取的人肝癌SMMC－7721细胞系和人肺腺癌SPC－A－1细胞系是否有明确的细胞毒性作用，阳性对照是5－FU 及顺铂，［11，12］实验结果显示：SMMC－7721和SPC－A－1对5－FU 敏感性较高，SPC－A－1对鹿茸各组分蛋白不敏感，不同分子量的鹿茸蛋白组分组间比较，细胞毒性无统计学差别（P＞0.05）；而SMMC－7721细胞对顺铂及鹿茸蛋白低度敏感，说明鹿茸各分子量蛋白组分有轻微抑制SMMC－7721细胞生长的作用，与顺铂作用相似，而且抑制作用与浓度呈正相关，虽然这种细胞毒性与5－FU相比有明显的差异（P＜0.05），但因其抑制率超过30%，说明了鹿茸蛋白组分具有轻度抑制肿瘤生长的作用。可进一步进行信号传导通路方面的研究，明确其作用机制。

另外，本研究还探讨了鹿茸蛋白组分促进淋巴细胞转化增殖活性，研究结果显示：鹿茸蛋白组分均具有明确的促进淋巴细胞转化功能，其中，高剂量组与胸腺肽阳性对照组具有相似的促进淋巴细胞转化活性，两者没有明显的差异（P＞0.05）。提示鹿茸蛋白组分的抗肿瘤作用可能还有免疫学途径的参与，值得进一步研究。

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