儿茶素对受照射大鼠急性肺损伤的保护作用及对TGF-β表达的影响

2012-11-20石卫民陈龙华宋维舒广东省第二人民医院肿瘤一科广东广州5037

中国老年学杂志 2012年22期

石卫民高蕾陈龙华宋维舒 (广东省第二人民医院肿瘤一科，广东广州 5037)

石卫民高蕾1陈龙华2宋维舒 (广东省第二人民医院肿瘤一科，广东广州 510317)

目的阐明儿茶素对大鼠急性放射性肺损伤的保护作用及肺组织TGF-β表达水平的影响。方法成年雌性Wistar大鼠40只，随机分作4组：(1)空白对照组：10只，腹腔注射生理盐水20 ml·kg－1·d－1。(2)单纯儿茶素组：10只，腹腔注射儿茶素注射液100 mg· kg－1·d－1。(3)单纯照射组：10只，全肺单次照射15 Gy+腹腔注射生理盐水20 ml·kg－1·d－1。(4)照射+儿茶素组：10只，全肺单次照射15 Gy+儿茶素注射液100 mg·kg－1·d－1。于照射后2 w及6 w取各组大鼠5只，取肺组织作组织学与免疫组化分析。结果照射组大鼠2 w和6 w时肺出现明显炎性损伤，照射+儿茶素组的急性肺炎性改变较照射组明显减轻;空白对照组和单纯儿茶素组动物免疫组化TGF-β阳性细胞数相对较低，单纯照射组的TGF-β阳性细胞数较上述两组明显增高(P＜0.05)，照射+儿茶素组的阳性细胞数介于两者之间，也显著低于单纯照射组(P＜0.05)。结论儿茶素对大鼠急性放射性肺损伤具有保护作用，而儿茶素能明显降低该过程中TGF-β表达水平。提示儿茶素可能通过调控该细胞因子而起到辐射防护的作用。

儿茶素;肺;辐射损伤;TGF-β

射线辐射可以导致机体产生各种损伤，引起突变，诱发肿瘤及引起衰老。主要机制是放射线作用使机体产生大量自由基导致脂质过氧化。近年来有研究发现儿茶素是一种有效的羟自由基清除剂，能有效清除多种自由基，使射线的间接作用对机体损伤大为减少，从而起到辐射防护作用〔1〕。儿茶素主要有4种单体成分：表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素(EGC)和表儿茶素(EC)，有研究发现其单体及混合体对不同组织具有不同程度的辐射防护作用，其研究见于对于外周血淋巴细胞、小肠绒毛细胞等〔2～5〕。而目前尚未见对于放射性肺损伤的研究。转化生长因子β(TGF-β)被认为是与放射性肺损伤发生发展关系最为密切的细胞因子。本实验研究儿茶素混合体对大鼠急性放射性肺损伤以及肺组织TGF-β表达的影响和作用。

1 材料与方法

1.1 动物及儿茶素混合品

雌性Wistar大鼠，购自购自广州省实验动物中心，体重(200±20)g。供试前在SPF级清洁动物房常规饲养3 d，观察无异常者进入实验。儿茶素混合体(EGCG 50% ～60%，EGC 30%，余为ECG和EC)购自广东省中药研究所，纯度95%以上。

1.2 照射条件

使用美国瓦里安公司的VARIAN 2300C直线加速器(广州中医药大学广东省中医院放疗科)产生的6 MV X线。照射时大鼠清醒状态俯卧于体模固定板上，用瓦里安直线加速器6 MV X射线等距离照射全肺，照射野上界平大鼠腋窝，下界平胸骨剑突，左、右至胸廓外侧，大鼠全身其余部分用挡铅屏蔽。源皮距为 100 cm，计算点深度为 2 cm，剂量率为320 cGy/min，一次性照射剂量为15 Gy。

1.3 方法

①实验大鼠随机分为4组：对照组10只，儿茶素组10只，照射组10只，儿茶素加照射组10只。儿茶素加照射组动物每日予儿茶素溶于蒸馏水中，100 mg·kg－1·d－1予大鼠腹腔注射，从照射前1 d开始，直至照射后第6天，共腹腔注射7 d;单纯儿茶素组以 100 mg·kg－1·d－1予大鼠腹腔注射7 d。实施照射后2 w、6 w，各组动物随机取5只，处死后分别取肺组织在10%中性甲醛缓冲液中固定准备制作病理蜡块。②HE染色光镜观察：由病理科医生在显微镜下观察肺组织病理学变化(盲法)。③肺组织TGF-β蛋白免疫组化染色检测：一抗为Abcan生物技术公司兔抗鼠多克隆抗体，抗体工作浓度为8 μg/ml;二抗为福州迈新公司通用试剂盒，按试剂盒说明书操作。每张切片在400倍视野下选取10个有代表性、无重叠、不连续视野，盲法计数阳性细胞，取平均数。

1.4 统计学分析

各组动物TGF-β染色阳性的细胞数比较用t检验，用SPSS13.0软件进行统计分析。

2 结果

2.1 肉眼观

大鼠肺照射2、6 w后，解剖肉眼可见单纯照射组小鼠的肺组织表面明显点片状充血、出血病灶;而在照射+儿茶素组的肺组织仅呈充血状，未见明显出血病灶。

2.2 组织学结果

单照射组大鼠肺损伤较重，包括肺泡内出血及肺泡、支气管上皮、血管的改变，血管周围水肿均较明显，特别是在单照射组大鼠由于肺泡出血引起肺实质灶性实变和肺泡上皮水肿。而儿茶素+照射组大鼠的肺泡间隔增厚、上皮细胞的损伤、血管的改变程度都较照射组减轻，见图1。

2.3 免疫组化

①镜下观：空白对照组和单纯儿茶素组，在其支气管上皮中TGF-β呈不均一表达，在肺实质中少量肺泡巨噬细胞呈阳性表达，而血管内皮和肌层均呈阴性。单纯照射组和照射+儿茶素组大鼠，2 w后即可见大量肺泡巨噬细胞和Ⅱ型肺泡细胞呈阳性表达，持续到照射后6 w。②阳性细胞计数：空白对照组和单纯儿茶素组阳性细胞数相对较低，为(16±5)及(21±8)个。照射后2 w单纯照射组的阳性细胞数为(168±21)个，较上述两组明显增高(P＜0.05);照射+儿茶素组的细胞数为(74±17)个，显著低于单纯照射组(P＜0.05)。照射后6 w单纯照射组的阳性细胞数为(133±32)个仍高于照射+儿茶素组的细胞数〔(56±18)个，P＜0.05〕。见图2。

图1 各组大鼠肺组织病理学改变(HE，×100)

图2 各组大鼠肺组织TGF-β表达(×200)

3 讨论

儿茶素具有抗衰老、抑制炎症反应、抑制肿瘤细胞增殖以及诱导肿瘤细胞凋亡等作用〔6～8〕。Matuo等〔9〕研究在 EGCG 处理和不处理的情况下用γ射线照射质粒DNA，测量pUC118 DNA双链断裂的数量，并且测定酵母细胞照射后突变的频率，发现EGCG减少了γ射线导致的DNA损伤，也减少了照射引起的突变。Nair等〔5〕体外研究证实EC对质粒pBR322 DNA具有γ射线防护作用，在体实验以EC处理大鼠1 h后全身照射γ射线4 Gy，用碱性彗星分析法测定其外周血淋巴细胞的DNA链断裂情况，发现EC减轻了外周血淋巴细胞的DNA损伤。Lee等〔4〕研究经4种儿茶素单体或混合物处理后，大鼠经γ射线照射后的小肠绒毛存活、内生脾集落形成、小肠绒毛细胞凋亡情况，发现几种儿茶素都对实验动物具有辐射防护作用，4种单体混合物的放射防护作用强过任何一种单体。本研究采用儿茶素混合体，各个儿茶素单体对大鼠肺组织急性损伤的防护情况有待进一步研究。

放射性肺损伤，包括早期放射性肺炎和晚期放射性肺纤维化，是胸部肿瘤放疗、骨髓移植预处理的常见并发症，是一个有多种细胞参与、多种细胞因子调控的复杂过程，当肺脏受到照射后，分泌介导放射性肺损伤发生的细胞因子，包括TNF-α，IL-1α，IL-1β，IL-4，MCP-1 以及 TGF-β，PDGF，IGF-1，bFGF 等，介导了之后一系列损伤事件发生，产生病理组织学改变〔10〕。TGF-β被认为是与放射性肺纤维化发生关系最为密切的细胞因子，它不仅促进成纤维细胞的增殖及分化，而且可诱导肺泡巨噬细胞、中性粒细胞及淋巴细胞参与炎性反应。文献报道，大鼠肺照射后早期即出现 TGF-β 的表达，血清中 TGF-β 升高〔11～13〕。本研究说明下调了肺组织TGF-β的表达，起到减轻肺组织急性炎性损伤的作用。

本研究证实儿茶素混合体对大鼠照射肺有一定保护作用，能够减轻急性放射性肺损伤，可能是因为其能够降低组织TGF-β的分泌。在肺损伤发生发展过程中是否有其他细胞因子分泌的改变尚不清楚，各种儿茶素单体对大鼠肺组织的放射防护情况也有待进一步研究。

1 Jun X，Deji S，Ye L，et al.Comparison of in vitro antioxidant activities and bioactive components of green tea extracts by different extraction methods〔J〕.Int J Pharm，2011;408(1-2)：97-101.

2 Yamamoto T，Staples J，Wataha J，et al.Protective effects of EGCG on salivary gland cells treated with gamma-radiation or cis-platinum(Ⅱ)diam-mine dichloride〔J〕.Anticancer Res，2004;24(5A)：3065-73.

3 Katiyar SK，Mukhtar H.Green tea polyphenol(-)-epigallocatechin-3-gallate treatment to mouse skin prevents UVB-induced infiltration of leukocytes，depletion of antigen-presenting cells，and oxidative stress〔J〕.J Leukoc Biol，2001;69(5)：719-26.

4 Lee HJ，Kim JS，Moon C，et al.Modification of gamma-radiation response in mice by green tea polyphenols〔J〕.Phytother Res，2008;22(10)：1380-3.

5 Nair CK，Salvi VP.Protection of DNA from gamma-radiation induced strand breaks by Epicatechin〔J〕.Mutat Res，2008;650(1)：48-54.

6Relja B，T¨ottel E，Breig L，et al.Effects of green tea catechins on the proinflammatory response after haemorrhage/resuscitation in rats〔J〕.Br J Nutr，2011;4(1)：1-7.

7 Yang WH，Fong YC，Lee CY，et al.Epigallocatechin-3-gallate induces cell apoptosis of human chondrosarcoma cells through apoptosis signal-regulating kinase 1 pathway〔J〕.J Cell Biochem，2011;112(6)：1601-11.

8 Xu Y，Zhang JJ，Xiong L，et al.Green tea polyphenols inhibit cognitive impairment induced by chronic cerebral hypoperfusion via modulating oxidative stress〔J〕.J Nutr Biochem，2010;21(8)：741-8.

9 Matuo Y，Nishijima S，Ikeda T，et al.Radical scavenging effect of naturally-occurring epigallocatechin gallate against oxidative damage caused by gamma-ray radiation〔J〕.Radioisotopes，2008，57(12)：119-20.

10 张海，王炳胜，刘秀芳，等.益气活血中药对大鼠TGF-β1、TNF-α的影响〔J〕.中华放射医学与防护杂志，2009;29(4)：383-5.

11 方向明，胡春洪，胡晓云，等.兔放射性肺损伤模型的建立及鉴定〔J〕.中华放射医学与防护杂志，2010;30(4)：417-22.

12 Lee KH，Rhee KH.Radioprotective effect of cyclo(L-Phenylalanyl-LProlyl)on irradiated rat lung〔J〕.J Microbiol Biotechnol，2008;18(2)：369-76.

13 吴稚冰，马胜林，张爱琴，等.痰热清注射液对大鼠急性放射性肺损伤的防治〔J〕.中华放射医学与防护杂志，2008;28(4)：364-7.

R730.55

〕 A

1005-9202(2012)22-4945-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.22.042

2009年广东省科技计划项目(No.93053)

1 广州中医药大学第二附属医院大学城医院

2 南方医科大学南方医院放疗科

宋维舒(1962-)，男，主任医师，主要从事肿瘤放射治疗学研究。