两种血管性痴呆模型大鼠学习记忆能力与海马自由基代谢的比较

李志勇 赵 晖 张 琪 (中央民族大学中国少数民族传统医学研究院，北京 0008)

两种血管性痴呆模型大鼠学习记忆能力与海马自由基代谢的比较

李志勇 赵 晖1张 琪1(中央民族大学中国少数民族传统医学研究院，北京 100081)

目的 观察两种拟血管性痴呆(VD)模型大鼠学习记忆能力及海马组织自由基代谢变化。方法 采用线栓法和双侧颈总动脉结扎法分别制备大脑中动脉梗死(MCAO)和慢性脑低灌注型(CCA)VD模型，Morris水迷宫检测痴呆大鼠的学习记忆功能，生化法检测模型大鼠海马组织中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的含量变化。结果 在训练的1～4 d，MCAO模型和CCA模型大鼠逃避潜伏期和游泳路径延长(P＜0.05，P＜0.01)，CCA模型出现逃避潜伏期和游泳路径延长的时间早于MCAO模型(P＜0.05，P＜0.01);MCAO模型大鼠的dP/dT和穿环次数均明显减少(P＜0.05，P＜0.01);MCAO模型与CCA模型大鼠海马组织MDA含量明显增加，SOD、GSH-Px的含量则明显下降(P＜0.05，P＜0.01)，两种模型MDA、SOD、GSH-Px含量变化无显著差别。结论 CCA模型大鼠空间记忆能力下降明显，而MCAO模型记忆保持能力较差，MDA、SOD、GSH-Px代谢参与了MCAO和CCA所致血管性痴呆的病理过程。

血管性痴呆;大脑中动脉线栓;慢性脑低灌注;学习记忆功能;谷胱甘肽过氧化物酶;超氧化物歧化酶;丙二醛

血管性痴呆 (VD)是由一系列脑血管因素 (缺血、出血、急慢性缺氧性脑血管病)引起的脑组织血液循环障碍、脑部机能减退而致的一种认知功能缺损综合征〔1〕。可靠、稳定的VD动物模型是筛选抗VD药物和研究VD发病机制的前提。采用线栓法致大脑中动脉栓塞 (MCAO)或结扎双侧颈总动脉致慢性脑低灌注 (CCA)模拟VD状态，是目前常见的VD模型制备方法。本研究分别制备MCAO和CCA VD大鼠模型，比较两种模型大鼠的学习记忆功能及海马组织谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px)、超氧化物歧化酶 (SOD)、丙二醛 (MDA)的含量变化，以期了解上述两种VD模型大鼠的认知障碍差异，并分析海马组织自由基代谢改变与认识障碍的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物

S D大鼠，雄性，体重240～260 g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号SCXK(京)2004-0005。实验条件下自然饮食，适应环境3 d后进行实验。

1.2 试剂与仪器

GSH-PX测试盒(批号：20080320)，SOD测试盒(批号：20080320)，MDA测试盒(批号：20080320)及总蛋白测试盒均由(批号：20081320)，南京建成生物工程研究所提供。752N型分光光度计，上海精密科学仪器有限公司;TGL-16G型高速台式离心机，上海医用分析仪器厂;AEG-220电子分析天平，日本Shimadzu公司。

1.3 方法

1.3.1 MCAO与 CCA VD模型的制备 参考文献〔2〕制备MCAO VD模型。具体方法：大鼠麻醉后将其仰卧固定，分离右颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)及颈外动脉(ECA)并挂线备用，结扎ECA与 CCA，用动脉夹夹闭ICA远心端后，迅速于ECA与ICA分叉处作一切口，从切口处插入一端加热成光滑球形的尼龙线(直径0.265 mm)，置于颈内动脉17～18 mm，有轻微阻力感为止，实现大脑中动脉阻塞导致脑缺血。扎紧动脉残端，尼龙线外留约1 cm，缝合皮肤。2 h后轻轻提拉所留线头至有阻力，实现大脑中动脉再灌注，则造模完成。动物入选的标准：动物于缺血再灌注2 h后出现对侧前肢卷曲或行走转圈或行走向对侧倾倒，无此体征或于2 h后仍不清醒者弃去。参考文献〔2〕，制备CCA VD模型。具体方法：大鼠麻醉后，仰卧固定，颈正中去毛消毒后，颈正中切口，分离双侧颈总动脉，双重丝线结扎双侧颈总动脉，缝合伤口。假手术组仅游离双侧颈总动脉，各组大鼠同条件饲养。

1.3.2 学习记忆功能检测 利用Morris水迷宫对各组大鼠进行学习记忆能力检测。圆形水池直径98 cm、高60 cm，内壁涂成黑色，水深30 cm，水温(21±1)℃，直径8 cm的平台隐藏于水面下1 cm处，利用Morris水迷宫行为记录系统软件追踪大鼠在水迷宫中的运动轨迹、潜伏期、游泳速度及路径长度。实验过程分为空间参考记忆能力和工作记忆能力测试两部分。空间参考记忆能力测试时，平台放在水池西南象限(第Ⅲ象限)正中距池壁22 cm处，水迷宫周围标志物固定，无声、光、人的干扰，以供大鼠定位平台。整个实验过程包括：①隐藏平台获得实验：大鼠入池位置分别为平台所对及相邻象限，记录大鼠在90 s内成功进驻平台(找到平台并滞留5 s)所需时间(即逃避潜伏期)和游泳路径，如在90 s内大鼠不能成功进驻平台，则逃避潜伏期记为90 s，并将大鼠引上平台停留5 s，引导其学习与记忆。每只大鼠每天训练4次，计算每天各组大鼠寻找平台的逃避潜伏期和游泳路径平均值;②空间搜索实验：隐藏平台获得实验结束后第5天撤除平台，在平台相邻象限将大鼠面向池壁放入水中，在30 s内观察并记录：以原平台所在的象限(第Ⅲ象限)作为目标区，测量各组大鼠的平台象限游泳时间与总游泳时间比值(tP/tT);以原平台所在的象限(第Ⅲ象限)作为目标区，测量各组大鼠在平台象限的游泳距离占总游泳距离比值(dP/dT);记录各组大鼠在水池中穿过原平台所在位置的次数，即穿环次数。

1.3.3 大鼠海马组织自由基代谢 学习记忆功能检测后，处死大鼠，取全脑，冰浴上分离大脑海马组织，Tris-组织蛋白抽提试剂提取组织蛋白抽提液，按试剂盒说明书考马斯亮蓝法测定缺血脑组织GSH-PX、SOD、MDA的含量。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠学习记忆功能变化

隐藏平台获得实验，在第1～4天CCA模型组大鼠的逃避潜伏期较假手术组明显延长(P＜0.05，P＜0.01)，在第2～4天模型组游泳路径较假手术组明显增加(P＜0.01);MCAO模型组大鼠在第3、4天逃避潜伏期较假手术组明显增加(P＜0.05，P＜0.01)，在第3天游泳路径与假手术组比较有明显增加(P＜0.01);CCA模型组与MCAO模型组比较，在测试的第2、4天时，CCA模型组大鼠的逃避潜伏期与游泳路径较MCAO模型组明显增加(P＜0.05，P＜0.01)。见表1。

空间探索实验结果显示经训练后，MCAO模型组dP/dT和穿环次数较假手术组明显减少(P＜0.05，P＜0.01);CCA模型组与假手术组大鼠tP/tT、dP/dT与穿环次数无统计学差异;CCA模型组大鼠与MCAO模型组比较，CCA模型组的tP/tT、dP/dT较MCAO模型组明显减少(P＜0.01)。见表2。

2.2 大鼠海马自由基代谢变化

MCAO模型组大鼠海马组织MDA含量明显升高(P＜0.01)，GSH-Px与SOD含量明显下降(P＜0.05，P＜0.01);与CCA假手术组比较，CCA组大鼠海马组织MDA含量明显升高(P＜0.01)，而GSH-Px和SOD含量则明显下降(P＜0.01);MCAO与CCA模型组大鼠海马组织的MDA、GSH-Px与SOD变化无显著差别。见表3。

与MCAO假手术组比较，

表1 大鼠搜寻固定平台逃避潜伏期和游泳路径的变化s)

表1 大鼠搜寻固定平台逃避潜伏期和游泳路径的变化s)

与假手术组比较：1)P＜0.05，2)P＜0.01;与 MCAO 组比较：3)P＜0.05，4)P＜0.01

组别 n 潜伏期(s)第1天 第2天 第3天 第4天游泳路径(cm)第1天 第2天 第3天 第4天MCAO假手术组 12 45.75±9.55 19.4±7.38 13.2±5.27 11.37±6.62 2 303.7±449.94 943.13±358.65 569.02±226.52 655.44±396.25 MCAO模型组 10 46.49±9.52 22.9±7.76 22.62±13.182)18.77±11.311)2 199.7±434.47 1 136.92±456.331541.10±917.572)919.64±465.43 CCA假手术组 12 36.2±9.3 17.7±6.6 19.8±10.8 14.7±9.8 1 768.6±397.7 849.7±381.5 897.8±481.6 720.1±484.7 CCA模型组 13 46.0±11.01) 33.0±15.02)3) 34.5±12.72) 29.6±11.22)3) 2 210.0±602.6 1 689.5±584.12)4)1 613.5±583.32)1 381.7±427.02)4)

表2 大鼠空间探索能力的变化(s)

表2 大鼠空间探索能力的变化(s)

与假手术组比较：1)P＜0.05，2)P＜0.01;与MCAO组比较：3)P＜0.01

组别 n tP/tT(%) dP/dT(%) 穿环次数(次)MCAO假手术组1.04±1.06 12 27.77±6.63 29.93±4.67 1.22±0.67 MCAO模型组 10 27.31±11.48 25.81±12.671)0.55±0.822)CCA假手术组 12 0.26±0.08 0.23±0.07 1.18±0.08 CCA模型组 13 0.19±0.073) 0.19±0.073)

表3 VD大鼠海马组织自由基代谢的变化(n=8s)

表3 VD大鼠海马组织自由基代谢的变化(n=8s)

与假手术组比较：1)P ＜0.05，2)P ＜0.01

组别 n MDA(nmol/mg)GSH-Px(U/mg)SOD(U/mg)MCAO假手术组12 1.95±0.60 12.25±2.99 644.9±72.21 MCAO模型组 10 3.10±0.972) 3.23±1.071)385.33±59.432)CCA假手术组 12 1.97±0.74 9.73±3.55 687.70±119.09 CCA模型组 13 3.30±0.882) 4.17±2.782)415.27±68.872)

3 讨论

MCAO和CCA模型是目前常见的VD模型制备方法，两种模型具有制备方法简单、缺血灶明确、创伤小、可重复性强等特点。在病理损伤与学习记忆功能改变上，两种模型各具特点。MCAO模型大鼠的大脑中动脉栓塞侧海马及皮质处于长期低灌注损伤状态，除了可导致学习记忆相关的脑组织病理性损伤外，同时兼具有模拟动脉粥样硬化管腔狭窄所致的大脑低灌注学习记忆功能下降〔3〕;MCAO模型大鼠有明显的学习记忆障碍，其在Morris水迷宫中学习寻找平台的能力、对平台在水迷宫中的空间位置记忆均显著下降。CCA模型大鼠脑血流速度迅速下降，须经数月的代偿和适应才能恢复正常，脑血流下降最明显的部位是皮层和白质，海马次之;CCA模型大鼠的视空间学习能力、恐惧阈值和非空间记忆能力均受到损害，其在Morris水迷宫中的游泳时间增加，逃避潜伏期增加，在八臂辐射迷宫中的错误次数增多〔4〕。

Morris水迷宫是用于研究大鼠海马和脑区受到损害后学习、记忆能力变化的常用仪器，是目前检测大鼠空间学习记忆的主要手段〔5〕。Morris水迷宫的隐藏平台获得实验通过记录大鼠每次寻找平台的逃避潜伏期和游泳路径，反映大鼠的空间参考记忆获得能力，逃避潜伏期和游泳路径越长则说明大鼠的空间位置记忆越差。本研究表明双侧颈总动脉结扎更易导致大鼠空间记忆能力下降。大脑中动脉梗阻导致的拟血管痴呆大鼠的记忆保持能力较差，而双侧颈总动脉结扎对大鼠的空间记忆保持能力影响较小。

现在越来越多的证据认为氧化应激参与多种神经退行性疾病过程，是导致神经元凋亡和坏死的共同毒理机制〔6～8〕。本研究显示，MCAO和CCA模型大鼠活性氧产生过多和(或)抗氧化能力下降，活性氧的清除不足是导致VD大鼠神经细胞损伤、认知功能下降的主要病理机制。

综上研究，MCAO和CCA两种模型大鼠均表现出学习记忆功能障碍，但CCA模型更易出现空间记忆能力下降，而MCAO模型则在记忆保持方面能力较差，表明两种动物模型在学习记忆功能障碍方面各具特点。两种模型大鼠海马组织MDA、SOD、GSH-Px等自由基代谢呈现相同变化趋势，表明氧自由基代谢参与了MCAO和CCA所致VD的病理过程，是由脑血管病变所致的神经退行性病变的共有机制〔9〕。

1 王 鹏.血管性痴呆的药物治疗进展〔J〕.中风与神经疾病杂志，2007;24(1)：120-2.

2 田金洲.血管性痴呆〔M〕.北京：人民卫生出版社，2003：598-607.

3 尹军祥，田金洲，黄启福，等.MCAO拟血管性痴呆大鼠模型的建立〔J〕.中国病理生理杂志.2003;19(8)：1144-7.

4 舒 怡，张 洪，章军建.慢性脑低灌注的实验研究进展〔J〕.中华脑血管病杂志(电子版)，2010;4(3)：199-206.

5 张均田，张庆柱.神经药理学研究技术与方法〔M〕.北京：人民卫生出版社，2005：298.

6 Isobe K，Ito S，Haneda M，et al.Cellular and systemic defense system against age-promoting stimuli〔J〕.Nagoya J Med Sci，2006;68(1-2)：9-18.

7 Bosco DA，Fowler DM，Zhang Q，et al.Elevated levels of oxidized cholesterol metabolites in Lewy body disease brains accelerate alpha-synuclein fibrilization〔J〕.Nat Chem Biol，2006;2(5)：249-53.

8 Radak Z，Toldy A，Szabo Z，et al.The effects of training and detraining on memory，neurotrophins and oxidative stress markers in rat brain〔J〕.Neurochem Int，2006;49(4)：387-92.

9 赵保路.自由基、天然抗氧化剂与神经退行性疾病〔J〕.生物物理学报，2010;26(4)：263-74.

Ability of learning and memory and free radical metabolism in hippocampus of two kinds of vascular dementia rats

LI Zhi-Yong，ZHAO Hui，ZHANG Qi.
China Minority Traditional Medical Center of Minzu University of China，Beijing，100081，China

Objective To observe the learning and memory function and the changes of free radical metabolism in hippocampus of two kinds of vascular dementia(VD)rats induced by middle cerebral artery occlusion(MCAO)and common carotid artery(CCA).Methods Rat models with MCAO were established by line embolism method.Rat models with CCA were prepared by a permanent ligation of the bilateral common carotid artery(2-VO).Then，the learning and memory function of rat models were detected by Morris water maze(MWM)，and the content changes of GSH-Px，SOD，MDA in hippocampus of rat models were tested by biochemical method.Results The escape latency and swimming length in the hidden-platform acquisition training with MWM were significantly prolonged in MCAO and CCA models when rats were swimming trained on 1～4 d(P＜0.01 orP＜0.05).The extended escape latency and swimming length were appeared earlier in CCA models than those of MCAO models(P＜0.01 orP＜0.05)，and the dP/dT and crossing circle times were decreased in MCAO models(P ＜0.05，P ＜0.01).The content of MDA was increased，the contents of SOD and GSH-Px were reduced in hippocampus of MCAO and CCA models(P ＜0.05，P ＜0.01).But in the 2 kinds of models，there were not any significant differences in the content changes of MDA，SOD and GSH-Px.Conclusions The spatial memory is decreased significantly in CCA model，and the memory retention is poor in MCAO model.The metabolism of MDA，SOD and GSH-Px contribute to pathological process of VD induced by MCAO and CCA.

Vascular dementia;MCAO;CCA;Learning and memory function;GSH-Px;SOD;MDA

R749

A

1005-9202(2012)22-4940-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.22.040

国家自然科学基金面上项目(No.30973782);国家自然科学基金青年基金项目(No.81001693);北京市中医药科技基金资助项目(No.JJ2008-042)

1 首都医科大学中医药学院

赵 晖(1973-)，女，副教授，博士，主要从事脑血管疾病的基础研究。

李志勇(1978-)，男，副研究员，博士，主要从事民族药防治神经退行性病的药效与物质基础研究。

〔2011-10-21收稿 2012-01-10修回〕

(编辑 张永贵/胡国义)