复方石斛合剂调节胰岛素受体表达促进HepG2细胞糖代谢

张捷平 秦崇涛 林 凡 施 红 (福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州 350108)

复方石斛合剂调节胰岛素受体表达促进HepG2细胞糖代谢

张捷平 秦崇涛 林 凡 施 红 (福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州 350108)

目的 探讨复方石斛合剂增加HepG2细胞胰岛素信号促进葡萄糖代谢的机制。方法 以高胰岛素培养HepG2细胞24 h，诱导胰岛素抵抗(IR)状态，继以10%复方石斛合剂的含药血清干预48 h，测定细胞6-磷酸果糖激酶、异柠檬酸脱氢酶的活性，RT-PCR与免疫印迹胰检测岛素受体mRNA与蛋白水平的表达。结果 高浓度胰岛素能降低6-磷酸果糖激酶、异柠檬酸脱氢酶的活性，降低胰岛素受体的表达;复方石斛合剂的治疗能增加6-磷酸果糖激酶、异柠檬酸脱氢酶的活性(P＜0.05)，促进胰岛素受体的转录与翻译水平表达(P＜0.05)，逆转高胰岛素的下调影响。结论高浓度胰岛素可诱发IR，复方石斛合剂能增加HepG2细胞胰岛素受体的表达，提高葡萄糖分解代谢关键酶活性，缓解IR。

复方石斛合剂;胰岛素抵抗;糖代谢;胰岛素受体

胰岛素抵抗(IR)是糖尿病、肥胖等代谢性疾病的共同的病理生理基础〔1〕。高胰岛素血症，其既被认为是IR发展的病理生理特征，同时也会加重IR的进展〔2，3〕。本课题组前期系列研究表明，复方石斛合剂能明显降低STZ诱导的糖尿病大鼠的血糖、糖化血清蛋白，促进胰岛素分泌，改善 IR 状态〔4，5〕;临床实验也表明，该方药能降低2型糖尿病患者的血糖、糖化血清蛋白，纠正糖耐量异常，提高胰岛素敏感性，改善胰岛素抵抗指数(ISI)〔6〕。本研究以HepG2细胞为对象，从细胞分子水平探讨该方药对高胰岛素状态诱发IR的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

复方石斛合剂(石斛、黄芪、丹参、五味子、葛根、生地黄、玄参、川牛膝)购自福建中医药大学国医堂。清洁级SD大鼠，雄性，体质量250～300 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SYXK(沪)2007-0005。HepG2细胞，购自上海细胞所。胎牛血清、DMEM培养基(Gibco，美国);果糖-6-磷酸、醛缩酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸甘油脱氢酶、异柠檬酸、Actin一抗(Sigma，美国);琼脂糖、NADH、NAD、ATP、ADP、DTT、PMSF(Amresco，美国)，SDS-PAGE 试剂盒、ECL(碧云天生物公司)，InsR-β 一抗(#3020，Cell Singaling，美国);Trizol、PCR引物(Invitrogen，美国);RT-PCR试剂盒、DNA分子量(Fermentas，美国);其他常用化学试剂(上海国药试剂公司)。

1.2 方法

1.2.1 复方石斛合剂含药血清的制备 复方石斛合剂以6倍水煎2次后过滤，两次滤液合并后最终调至含生药量1 g/ml。SD大鼠30只，随机分为2组，即空白对照组和中药组，每组15只。各组动物在同样条件下饲养，早晚各1次灌胃给药(空白对照组：等量的生理盐水;中药组：复方石斛合剂)用药剂量依据2000年版《中华人民共和国药典》根据人和动物体表面积折算的等效剂量比率表计算，连续7 d。于末次灌胃(灌胃前禁食不禁水12 h)后2 h，乙醚麻醉，腹主动脉采血，低速离心分离血清，将每组动物的血清混合。经56℃ 30 s灭活，经微孔滤膜过滤除菌后，置－20℃冰箱备用。

1.2.2 HepG2细胞培养及分组干预 HepG2细胞用含10%胎牛血清的DMEM培基，在37℃，5%CO2环境中培养、传代。待细胞生长至80%接触，以无血清培养2 h，进行如下处理：分为4组：对照组、高胰岛素组、中药组、高胰岛素+中药组。上述各组先以 10－9、10－7、10－9、10－7mol/L 的胰岛素培养 24 h后，A、B组分别加入10%空白对照大鼠血清、给药组分别加入10%含药大鼠血清继续培养48 h。检测前，去掉旧培基，加入2 ml含10－9mol/L胰岛素的无血清培养基于37℃温育待测细胞15'后，检测以下指标。

1.2.3 葡萄糖代谢关键酶活性的测定 用PBS洗三次，加入100 μl提取液〔含50 mmol/L PBS(pH 7.2)，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF，1 mmol/L DTT〕，刮下细胞，超声破碎离心取上清液，用于酶活性测定。

1.2.3.1 6-磷酸果糖激酶-1(PFK)活性测定 根据Narabayashi等的方法〔7〕，在30℃反应体系监测340 nm处NADH的吸光度。PFK活性计算按：2 μmol/L NADH的减少相当于1 μmol/L 1，6-二磷酸果糖的产生。

1.2.3.2 异柠檬酸脱氢酶(ICDH)活性测定 根据Rutter等〔8〕的方法，在30℃反应体系监测340 nm处NADH的吸光度。

1.2.4 半定量RT-PCR检测细胞胰岛素受体转录水平 用TRIzol法提取细胞总RNA，以Olig(dT)18为引物42℃逆转录合成cDNA，继以引物1(上游5'-agtttgaggacatggagaatgtg-3'，下游5'-ataggaacgatctctgaactccac-3'，318 bp)与引物 2(上游 5'-tgtaaccaactgggacgatatg-3'，下游 5'-atctcttgctcgaagtctaggg-3'，456 bp) 分别扩增胰岛素受体(InsR)与管家基因β-actin。反应条件：变性94℃，30 s;退火 55℃(InsR)或 57℃(β-actin)30 s;延长 72℃，30 s;循环30次。扩增产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳分析结果。

1.2.5 Western印迹检测细胞蛋白水平的表达 培养细胞，经PBS洗涤3次，加入全细胞裂解液，冰上裂解，超声破碎，于4℃

离心15 s，上清为总蛋白提取液。取80 μg蛋白，以8%的SDSPAGE分离胶分离，全湿式电转膜法将目的蛋白转印至PVDF膜上。3%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别加入稀释的抗 InsR(1∶1 000)、抗 Actin(1∶2 000)的抗体，室温杂交 1 h。用 PBST洗膜3次，每次5 s。续分别加入1∶2 000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温下温育1 h，同样洗膜3次，然后化学发光显影。用BandScan图像分析系统对上述PCR与Western印迹结果的区带进行光密度(IA)扫描，以β-Actin为内对照，对InsR基因表达进行定量分析。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 葡萄糖代谢关键酶活性变化

高浓度胰岛素(10－7mol/L)刺激HepG2细胞24 h，发现PFK与ICDH的活性较生理高胰岛素(10－9mol/L)刺激的细胞的酶活性显著降低(P＜0.05)。细胞在高胰岛素刺激24 h之后，加入10%含药血清继续培养48 h，PFK与ICDH的活性比高浓度胰岛素组明显提高(P＜0.05)，比对照组稍低，但没有显著性差异(P＞0.05)。见表1。

表1 不同浓度胰岛素及复方石斛合剂对PFK、ICDH活性影响( ± s，n=8，nmol·min－1·mg －1)

表1 不同浓度胰岛素及复方石斛合剂对PFK、ICDH活性影响( ± s，n=8，nmol·min－1·mg －1)

与对照组比较：1)P＜0.05;与高胰岛素组比较：2)P＜0.05，下表同

60.79±4.42 1.74±0.17高胰岛素组 38.68±5.251) 1.45±0.251)中药组 65.68±4.73 1.85±0.27高胰岛素+中药组 55.07±5.012) 1.64±0.202)PFK ICDH对照组组别

2.2 胰岛素受体表达变化

高浓度胰岛素(10－7mol/L)刺激HepG2细胞24 h，发现InsR mRNA和蛋白质水平明显下降(P＜0.05)较生理高胰岛素(10－9mol/L)刺激的对照组显著降低(P＜0.05)。高浓度胰岛素刺激24 h，再加入10%含药血清继续培养48 h，InsR mRNA和蛋白质表达比高浓度胰岛素组有明显提高(P＜0.05)。比对照组稍低，但没有显著性差异(P＞0.05)。见图1、2及表2。

图1 胰岛素及复方石斛合剂对InsR mRNA表达影响

表2 不同浓度胰岛素及复方石斛合剂对InsR mRNA与蛋白表达的比率分析(± s，n=5)

表2 不同浓度胰岛素及复方石斛合剂对InsR mRNA与蛋白表达的比率分析(± s，n=5)

0.79±0.12 0.96±0.15高胰岛素组 0.33±0.191) 0.42±0.171)中药组 0.85±0.13 0.98±0.20高胰岛素+中药组 0.72±0.172) 0.93±0.212)蛋白质对照组组别 mRNA

图2 胰岛素及复方石斛合剂对InsR蛋白表达影响

3 讨论

胰岛素是胰岛β细胞合成与分泌的一种蛋白质激素，通过与靶细胞膜上InsR的细胞外α亚基结合，引起细胞内β亚基酪氨酸残基磷酸化，即激活受体本身的酪氨酸激酶活性，使之成为激活态，进一步活化细胞内特定信号蛋白，从而发挥调节代谢、蛋白质合成等生理效应。肝细胞中葡萄糖氧化分解的关键酶(如PFK、ICDH等)是胰岛素作用的靶酶之一，胰岛素可以通过直接或间接的化学修饰作用，使其磷酸化，快速增加酶活性，促进细胞内的葡萄糖利用。

研究表明参与胰岛素信号转导的分子(如InsR、IRSs、PI3K、Akt、PTP1B)等的数量、结构及分布的异常，将导致胰岛素信号转导障碍，诱发 IR状态〔9，10〕。在 IR的早期，机体胰岛素敏感性下降，胰岛β细胞能代偿性地增加分泌胰岛素，弥补效应不足;但是持续的高胰岛素血症会下调胰岛素敏感组织细胞的胰岛素信号分子表达，从而进一步加重胰岛素信号转导的障碍〔11〕。本实验以10－7mol/L胰岛素培养 HepG2细胞24 h，诱导InsR表达显著下降，制备得到IR的细胞模型。InsR作为细胞膜上胰岛素信号转换的关键蛋白，其数量减少将直接导致胰岛素信号跨膜转导减弱，并最终产生对生理剂量(10－9mol/L)胰岛素刺激的抵抗状态，导致糖代谢关键酶PFK、ICDH活性下降，葡萄糖氧化分解减少。

复方石斛合剂由石斛、黄芪、丹参、五味子、葛根、生地黄、玄参、川牛膝组成。本实验说明该方药具有促进肝细胞氧化分解葡萄糖的功效;同时在高浓度胰岛素培养24 h，再加入该含药血清培养48 h，能一定程度逆转InsR表达的减少，增加对生理水平胰岛素的敏感性，恢复PFK、ICDH活性，从而缓解高胰岛素诱导的肝细胞IR状态，对维持细胞正常的葡萄糖分解利用有重要意义。

由于参与胰岛素信号转导的信号分子较多，不同中药的作用不尽相同，已发现部分具备降糖作用的复方中药与单味中药直接作用于胰岛素信号转导分子，增加胰岛素的敏感性，缓解IR。如复方黄边降糖片及小檗碱增加不同组织细胞的InsR、IRS-1/2的蛋白表达，或促进蛋白酪氨酸残基磷酸化水平或抑制丝氨酸磷酸化〔12，13〕;麦花叶黄酮通过抑制PTP1B活性，改善IR〔14〕。因此复方石斛合剂是否也存在着对其他胰岛素信号分子表达或修饰的调节，值得进一步研究。此外，代谢酶的活性调节，主要包括快速调节与迟缓调节两种方式。该方药是否还存在直接上调代谢酶蛋白PFK、ICDH的表达从而增加酶活性，也是研究的方向。

1 Choi K，Kim YB.Molecular mechanism of insulin resistance in obesity and type 2 diabetes〔J〕.Korean J Intern Med，2010;25(2)：119-29.

2 Shanik MH，Xu Y，Skrha J，et al.Insulin resistance and hyperinsulinemia：is hyperinsulinemia the cart or the horse〔J〕?Diabetes Care，2008;31(2)：262-8.

3 Fernández-Veledo S，Nieto-Vazquez I，de Castro J，et al.Hyperinsulinemia induces insulin resistance on glucose and lipid metabolism in a human adipocytic cell line：paracrine interaction with myocytes〔J〕.J Clin Endocrinol Metab，2008;93(7)：2866-76.

4 施 红，杨奇红，张捷平，等.石斛合剂对高脂高糖加链脲佐菌素造模大鼠的作用〔J〕.中国临床康复，2004;8(6)：1102-4.

5 施 红，林 雅.石斛合剂改善模型大鼠胰岛素抵抗的实验研究〔J〕. 福建中医学院学报，2004;14(6)：24-6.

6 辛金钟，王麒又，陈丽娟，等.石斛合剂改善2型糖尿病胰岛素抵抗的临床研究〔J〕. 中国现代医生，2010;48(3)：58-9.

7 Liu YQ，Tornheim K，Jack L.Fatty acid-induced cell hyper-sensitivity to glucose increased phosphofructokinase activity and lowered glucose-6-phosphate content〔J〕.J Clin Invest，1998;101(9)：1870-5.

8 Rutter，GA，Denton RM.Rapid purification of pig heart NAD+-isocitrate dehydrogenase.Studies on the regulation of activity by Ca2+，adenine nucleotides，Mg2+and other metal ions〔J〕.Biochem J，1989;263(2)：445-52.

9 Hunter SJ，Garrey WT.Insulin action and insulin resistance：diseases involving defects in insulin receptors，signal transduction，and the glucose transport effector system〔J〕.Am J Med，1998;105(4)：331-45.

10 Bence KK.Hepatic PTP1B deficiency：the promise of a treatment for metabolic syndrome〔J〕?J Clin Metab Diabetes，2010;1(1)：27-33.

11 Gray SL，Donald C.Hyperinsulinemia precedes insulin resistance in mice lacking pancreatic beta-cell leptin signaling〔J〕.Endocrinology，2010;151(9)：4178-86.

12 宋菊敏，舒 适，刘小美，等.复方黄连降糖片对2型糖尿病大鼠IRS-1基因表达的影响〔J〕.上海中医药大学学报，2009;12(4)：71-4.

13 刘小美，宋菊敏，宋丽娜.小檗碱对2型糖尿病大鼠胰岛细胞InsR与IRS-1/-2蛋白表达的影响〔J〕.上海中医药大学学报，2010;24(4)：65-7.

14 韩淑英，王志路，储金秀，等.荞麦花叶黄酮对2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗及肝组织PTP1B的影响〔J〕.中国中药杂志，2009;34(23)：3114-8.

Dendrobium compound improving glucose metabolism in HepG2 cell by regulating insulin receptor expression

ZHANG Jie-Ping，QIN Cong-Tao，LIN Fan，et al.
College of Integrated TCM-WM，Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350108，Fujian，China

Objective To investigate Dendrobium Compound(DC)improving HepG2 cells glucose metabolism and the mechanism of insulin signal transduction.Methods Incubated HepG2 cells with high concentration insulin for 24 h to develop insulin resistance(IR)，followed by 10%compound mixture containing serum of DC 48 h，the activity of phosphofructo-1-kinase，isocitrate dehydrogenase and the mRNA and protein of insulin receptor were measured.Results High concentrations of insulin could reduce the activity of phosphofructo-1-kinase，isocitrate dehydrogenase，reduce expression insulin receptor.the expression on levels of transcription and translation.And DC treatment could increase the activity of phosphofructo-1-kinase，isocitrate dehydrogenase(P＜0.05)，improve insulin receptor transcription and translation levels(P＜0.05)，reverse the downregulation effect of high insulin.Conclusions High concentrations of insulin could induce IR in HepG2 cells.DC could improve glucose metabolism and insulin signal transduction by enhancing the activity of key enzymes involved in glucose metabolism and the expression of insulin receptor，and alleviate IR.

Dendrobium compound;Insulin resistance;Glucose metabolism;Insulin receptor

R589.2

A

〕 1005-9202(2012)22-4930-04;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.22.036

福建省教育厅课题(No.JB08159)

施 红(1964-)，女，教授，博士生导师，主要从事中西医结合防治糖尿病临床与基础研究。

张捷平(1976-)，男，讲师，硕士，主要从事生物化学与分子生物学研究。

〔2011-08-22收稿 2011-12-11修回〕

(编辑 曹梦园)