亲和层析快速提取白果和大豆的抗氧化蛋白

王桂珍，凌辉生，谢丽思，李任强

（暨南大学生物工程学系，广东广州510632）

亲和层析快速提取白果和大豆的抗氧化蛋白

王桂珍，凌辉生，谢丽思，李任强*

（暨南大学生物工程学系，广东广州510632）

用环氧氯丙烷活化法把血红素结合于惰性分子筛填料Sephadex G-25上作为配基做成亲和层析柱，用于从白果或大豆中提取具有抗氧化活性的蛋白。此层析柱以去离子水为平衡液、0.2mol/L的NaAc-HAc缓冲液（pH3.6）为洗脱液，层析得到的蛋白经亚油酸-硫氰酸钾抗氧化活性测定证明具有较高的抗氧化活性。白果全蛋白的抗氧化活性为7.92%，经此方法提纯后得到2种抗氧化多肽，活性达到17.45%；而大豆中的抗氧化蛋白经纯化则得到多种，抗氧化活性由全蛋白时的10.52%提高至30.72%。这是一个新的、只需一个步骤即可从白果或大豆蛋白提取液中提取到具有高抗氧化活性蛋白的方法，具有成本低，快速高效的特点。

血红素，亲和层析，白果，大豆，抗氧化蛋白

外源性抗氧化剂可以帮助清除人体内过量的自由基，维持身体健康。许多天然食物具有抗氧化性，因为它们含有大量的抗氧化物质。植物性食品中的许多具有抗氧化活性的物质属于蛋白质类，它们对于抑制膜脂质过氧化、清除生物体内过量自由基等具有重要意义。白果清蛋白具有抗辐射损伤，恢复小鼠免疫机能等功效，对超氧阴离子自由基的清除率达50%左右，对羟基自由基的清除率在80%以上[1-2]。大豆蛋白可有效抵御机体的脂质过氧化，降低甲状腺和脑组织受自由基损伤的程度[3]。魔芋多肽对红细胞氧化溶血的抑制作用强于茶多酚[4]。许多研究说明，包括菜籽蛋白[5]、大豆蛋白[6]、白果蛋白[7]等，都具有抗氧化活性，所以，如何提取纯化它们成为了研究的一个重要内容。虽然从食物中提取抗氧化蛋白可采取不同的方法[8-13]，但这些方法一般或较繁杂或效率不高。本研究的目的就是探讨能简单快速且有效的提取白果、大豆中的抗氧化蛋白的方法。血红素由卟啉环在中心结合一个铁原子构成，也称为铁卟啉[14]，是一个性质极其活泼的辅酶，能与很多蛋白结合。血红素的铁有第五和第六配位键，能与物质通过电子转移（氧化还原）发生反应从而结合。抗氧化活性蛋白起作用时一般就是通过电子转移而实现，所以，如果把血红素固定在载体上，利用铁原子的第五、第六配位键的高活性，就有可能捕获抗氧化蛋白。基于此，本研究选用血红素作为配基做成亲和层析柱用于提取抗氧化蛋白。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

白果、大豆 从市场购买；Sephadex G-25惰性填料 广州奇华盛生物技术有限公司；氯化血红素Sigma公司；亚油酸、低相对分子质量蛋白质标记物、硫氰酸钾、EDTA等 广州斯佳生物科技有限公司，分析纯；其他用于活化惰性填料、固定血红素或做电泳等的试剂 均为分析纯。

层析柱 Milipore；核酸蛋白检测仪HD-2001-B-C型 上海嘉鹏；生物电泳图像分析系统FR-980型 上海复日科技；真空冷冻干燥器 Heto；低温高速离心机 Thermo Election Corporation；电泳系统配有Power Pac HV电泳仪和Mini-Protean 3电泳槽 Bio-Rad公司；紫外-可见分光光度计Gold Spectrcum54上海凌光。

1.2 实验方法

1.2.1 亲和层析柱的制备 Sephadex G-25惰性载体的活化：25g Sephadex G-25经充分浸泡后置于烧结漏斗，以1mol/L NaCl和去离子水分别洗涤数次，移至小烧瓶中，加入19mL 2mol/L NaOH、5mL环氧氯丙烷和25mL 56%1，4-二氧六环，于40℃恒温摇床中震荡充分活化2h后置于烧结漏斗中去掉活化液，用去离子水和0.1mol/L，pH9.5的Na2CO3-NaHCO3缓冲液洗涤后用于与配基血红素的偶联。

氯化血红素与Sephadex G-25载体偶联：氯化血红素先用少量15%的氨水溶解，然后加入去离子水至终浓度为2mmol/L，取29mL与已活化的载体混合。在40℃恒温摇床中慢速振荡偶联24h，置于烧结漏斗用去离子水洗掉未反应的试剂。把已偶联上血红素的Sephadex G-25装柱，得到一黑褐色的以血红素为配基的层析柱（柱体积为11cm×1.5cm）。

1.2.2 蛋白粗提液的准备 称取120g白果，脱皮洗净，加入冷的磷酸缓冲液（0.01mol/L，pH7.2），用匀浆机匀浆。匀浆在室温下缓慢搅拌30min后静置在4℃中浸提过夜，离心（4℃，10000r/min，30min）收集上清（重复离心三次以除去上清黄色浮油块状物）。上清液中加入硫酸铵至80%饱和度，4℃静置过夜；离心收集黄色沉淀，用少量磷酸缓冲液溶解，以去离子水透析除盐；透析后的溶液离心去沉淀即得蛋白粗提液。

称取100g大豆，水浸泡6h后用匀浆机匀浆。匀浆在室温下缓慢搅拌30min后静置在4℃中浸提过夜，离心（4℃，10000r/min，30min），收集上清（重复离心三次以除去上清乳黄色浮油块状物）。上清液中加入硫酸铵至80%饱和度，4℃静置过夜；离心收集黄色沉淀，用少量水溶解，以去离子水透析除盐；透析后的溶液离心去沉淀即得蛋白粗提液。

1.2.3 亲和层析操作 分别以NaAc-HAc缓冲液（0.2mol/L，pH3.6）、去离子水和Na2CO3-NaHCO3缓冲液（0.1mol/L，pH9.5）洗涤血红素层析柱，最后用去离子水平衡。10mL蛋白粗提液上柱，流速为0.2mL/min。上样完毕后，继续用去离子水洗脱，收集OD280出现峰值的洗脱液即未被柱子吸附的蛋白质（穿透峰），待OD280降至基线，换用0.2mol/L，pH3.6的NaAc-HAc缓冲液进行洗脱，收集出现峰值的洗脱液即被柱子吸附而后洗脱的蛋白质。

1.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定 经过透析除盐后，穿透峰液及洗脱蛋白液（经一定程度浓缩）各取0.05mL，分别加入等体积的蛋白样品溶解液混合，沸水浴处理2min后作为电泳样品。电泳所用的分离胶质量分数为13%，浓缩胶质量分数为4%。电泳结束后，经染色、脱色后，采用电泳分析系统获取图像进行分析。

1.2.5 血红素与蛋白的反应及其光谱分析 为了测定被血红素层析柱吸附的那部分蛋白是否真正能与血红素起反应，将这部分蛋白直接与血红素混合后，通过光谱分析来判断它们之间的关系。以考马斯亮蓝法[15]测定各蛋白样品的浓度。取已知浓度的蛋白100μL加入Tris缓冲液（0.05mol/L，pH8.0）稀释一定倍数，再加入10μL 2mmol/L的血红素在37℃下反应5min，用分光光度计进行扫描分析。

1.2.6 亚油酸-硫氰酸钾方法测定蛋白抗氧化活性

1.2.6.1 亚油酸过氧化反应 测定方法主要按参考文献[16]进行。在5mL具塞管加入1.5mL 0.15mol/L（pH7.0）的磷酸缓冲液，加入待测蛋白样品100μL，加入100μL 50mmol/L亚油酸的乙醇溶液和25μL 50mmol/L的FeCl2-EDTA溶液，采用漩涡分散器振荡后，盖上盖，于50℃暗处水浴保温4h。

1.2.6.2 蛋白样品抗氧化活性检测 另取具塞管，加入3mL 75%乙醇，上述亚油酸过氧化已反应4h的混合液100μL，100μL含1mol/L FeCl2的1.0mol/L HCl溶液，100μL 30%KSCN，采用漩涡分散器振荡3min后用蒸馏水调零，在480nm处测定溶液的吸光度AS。以水取代蛋白进行同样操作作为对照，测出抗氧化剂空白的吸光度A0。

测定重复多次，取平均值。蛋白抗氧化活力AA可由以下公式求出：

2 结果与分析

2.1 层析柱的分离作用

图1 白果蛋白粗提液在血红素-Sephadex G-25亲和层析柱上的洗脱峰Fig.1 Elution peak of ginkgo protein crude extract in hemin-Sephadex G-25 affinity chromatography column

图1、图2分别为白果与大豆蛋白粗提液经层析柱后的分离效果。不管是白果，还是大豆，大部分蛋白都不被血红素吸附而成为穿透峰（大峰），只有很少一部分的蛋白被吸附到亲和柱上，这部分蛋白为洗脱峰（小峰），可认为是与血红素有相互作用的蛋白。

图2 大豆蛋白粗提液在血红素-Sephadex G-25亲和层析柱上的洗脱峰Fig.2 Elution peak of soybean protein crude extract in hemin-Sephadex G-25 affinity chromatography column

2.2 SDS-PAGE结果

对各蛋白样品进行SDS-PAGE分析的结果如图3。白果和大豆蛋白中，大部分蛋白都不被血红素吸附，但被血红素吸附的蛋白也不只一种。在白果蛋白中，起码有二种以上的多肽能与血红素反应，而在大豆蛋白中，能被血红素吸附的蛋白种类则甚多。这说明血红素亲和层析能选择性地与相关蛋白作用。

图3 亲和层析各蛋白样品SDS-PAGE图谱Fig.3 SDS-PAGE of different protein samples with affinity chromatography

2.3 目标蛋白与血红素反应的结果

图4 白果和大豆的层析柱洗脱蛋白与血红素混合后的光吸收图谱Fig.4 Light absorption spectrum of ginkgo and soybean column chromatography eluting protein mixed with hemin

白果和大豆的亲和层析洗脱蛋白适当稀释后分别与血红素结合后在240～540nm波长范围的光吸收扫描结果如图4。不管是白果还是大豆，带蛋白峰（280nm）的血红素光谱（蛋白与血红素混合）与单纯血红素光谱比较，吸收峰出现了向长波长移动的现象，说明白果或大豆的洗脱蛋白与血红素相互作用发生了结合，是由于血红素作为配基而分离出来的蛋白。

2.4 目标蛋白的抗氧化活性

将已知浓度的蛋白分别进行不同倍数的稀释，使所有蛋白质终浓度为1.924mg/mL。对相同浓度的各蛋白样品的抗氧化活性测定的结果列于表1。

表1 不同蛋白样品的抗氧化活性Table 1 Antioxidant activity of different protein samples

从表1可看出，白果全蛋白具有一定的抗氧化活性，这些蛋白经过血红素亲和层析柱后，具抗氧化活性的蛋白被柱子吸附，未吸附蛋白失去了抗氧化活性，而由于具抗氧化活性蛋白的提纯，洗脱蛋白的抗氧化活性提高了2倍多。对于大豆，情况与白果相似，洗脱蛋白的抗氧化活性比全蛋白的活性提高了将近3倍。其穿透蛋白还保留了一些抗氧化活性，可能与进行亲和层析操作时，上样样品中蛋白含量较高（大豆蛋白含量相当高）有关。高含量蛋白可致使一小部分具抗氧化活性蛋白由于柱子亲和反应已饱和而不被吸附。

以上这些结果充分说明血红素亲和层析柱具有非常优良的吸附抗氧化蛋白的特性，能很好地选择性分离抗氧化蛋白。所以说，利用血红素亲和层析柱能快速、高效率地分离纯化抗氧化蛋白。血红素作为配基能吸附抗氧化蛋白可能与血红素的活泼性质和抗氧化蛋白的分子结构特性有关。蛋白的抗氧化性多与它们分子中巯基（-SH）含量以及氨基酸残基的组成有关[17]，它们起作用时一般发生电子的转移。而血红素正是以铁的电子转移表现其活泼性，所以能与抗氧化蛋白发生一定反应从而与之结合。

2.5 白果和大豆中抗氧化蛋白分析

从白果中得到的抗氧化多肽至少有两种，大豆中的抗氧化蛋白则种类较多。这些结果可能与大豆是高等植物而白果是低等植物有关，高等植物中抗氧化蛋白的种类要多些是符合植物进化的规律的。图1、图2和图3中都表明被亲和层析吸附的蛋白只是一小部分，测定结果则说明这小部分蛋白具有高抗氧化活性，这说明血红素作为配基能选择性地吸附具抗氧化活性的蛋白。然而，由于血红素的活泼性，可能一些非抗氧化但性质相当活泼的蛋白也可能与血红素结合而混在抗氧化蛋白中，但由抗氧化活性的测定结果可以看出，被分离的蛋白主要还是抗氧化蛋白，因为它们的抗氧化活性相当高。由图3还可初步判断，大豆和白果中有相似分子质量（20.1ku）的血红素结合蛋白或亚基，它们或在分子结构、功能上或在进化上有某些联系。深入研究比较它们可能对了解抗氧化蛋白的结构特点及其作用机理会有极大意义。

3 结论

把血红素结合于惰性分子筛填料Sephadex G-25上作为配基做成的亲和层析柱能选择性的从白果或大豆蛋白中吸附具抗氧化活性的蛋白，只经一个步骤就可达到快速有效提取食品中的抗氧化蛋白的目的。白果全蛋白的抗氧化活性为7.92%，经本方法提纯后得到起码2种多肽，抗氧化活性达到17.45%；而大豆中的抗氧化蛋白经纯化则得到多种，抗氧化活性由全蛋白时的10.52%提高至30.72%。实验结果说明，以血红素亲和层析法提取食品中的抗氧化蛋白具有成本低，快速高效的特点，适合放大和应用。

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Fast preparation of antioxidant proteins from ginkgo and soybean by using affinity chromatography

WANG Gui-zhen，LING Hui-sheng，XIE Li-si，LI Ren-qiang*
（Department of Biotechnology，Jinan University，Guangzhou 510632，China）

After Sephadex G-25 polymerbeads were activated by using epichlorohydrin，hemin was bound with them to prepare an immobilized hemin affinity chromatography column，which was used to prepare antioxidant proteins from ginkgo and soybean.Equilibrated with deionized water and eluted with pH3.6，0.2mol/L NaAc-HAc buffer，those proteins obtained from this column were demonstrated to possess high antioxidative activity（AA）after the measurement with linoleic acid-potassium thiocyanate.AA of crude proteins of ginkgo was 7.92%and two polypeptides of them were obtained with AA 17.45%after purification.In soybean，several polypeptides with AA 30.72%were obtained from the crude proteins with AA 10.52%.This method was a novel，rapid and effective method for preparation of antioxidant proteins from ginkgo and soybean.

hemin；affinity chromatography；ginkgo；soybean；antioxidant protein

TS201.2+1

B

1002-0306（2012）01-0278-04

2010－05－17 *通讯联系人

王桂珍（1984-），女，在读硕士研究生，研究方向：蛋白质工程。

暨南大学自然科学基金（640073）。