亲和仿生层析及在抗体纯化中的应用

卢慧丽，林东强，姚善泾



亲和仿生层析及在抗体纯化中的应用

卢慧丽，林东强，姚善泾

（浙江大学化学工程与生物工程学院，生物质化工教育部重点实验室，浙江 杭州 310027)

亲和仿生层析是一种新型的生物分离技术，可用于生物活性物质分离，尤其在抗体纯化中表现出良好的应用前景，具有价格低廉、结构稳定、特异性较高等优点。亲和仿生层析的核心是具有特定结构的仿生配基，主要包括化学合成配基和短肽配基两种，通常通过合理的手段进行筛选和设计。理性设计是一种行之有效的方法，针对一个特定的目标蛋白，随机地去选择配基是不可能的，必须采用理性设计构建一个合理的配基库，并通过高通量的筛选技术，才能得到合适的仿生配基。本文根据近年来国内外亲和仿生层析的研究进展，着重介绍了亲和仿生配基的筛选和设计以及在抗体纯化中的应用。

亲和仿生层析；化学合成配基；短肽配基；抗体；纯化；分子模拟

引 言

所谓亲和仿生层析就是模拟亲和层析的分离原理，即基于抗原-抗体、酶-底物或激素-受体间的高度特异性相互作用来进行层析分离，并对配基进行特别设计的一种新型的生物分离技术，可用于生物活性物质尤其是蛋白的分离纯化。与亲和层析类似，亲和仿生层析是利用目标蛋白与仿生配基间特异且可逆性结合的特性，从复杂的生物样品中分离目标蛋白，具有选择性强、纯化效率高等特点。亲和层析介质一般以固定化生物来源的蛋白基团作为功能配基，亲和力和特异性较强，是生物分离中效率和选择性最高的分离方法。然而生物亲和配基通常成本高、不稳定、洗脱条件苛刻等，这些缺点一定程度上限制了亲和层析的应用。因此，寻求一类与生物亲和配基具有相似活性、通过人工合成的小分子化合物，并取而代之，已成为克服生物亲和配基缺憾的重要途径。亲和仿生层析就由此而产生。

亲和仿生层析研究的初期阶段主要是利用常见的基团特异性化合物作为仿生配基，其中最具代表性的是金属螯合类[1-2]、活性染料类[3-4]，这些配基结构较为简单，研究者对配基的选择和利用仅建立在一般的经验之上，并未有针对性地进行筛选和设计，因此得到有价值的配基并不多，对目标蛋白的选择性也不如生物亲和配基。直到20世纪80年代中后期，随着组合化学和高通量筛选技术的发展，亲和仿生配基的研究进入了快速发展的阶段。研究者们开始针对目标蛋白进行理性设计，采用不同的方式建立仿生配基库，通过高通量筛选得到热点配基，再利用这些热点配基制备亲和仿生介质，通过目的明确的层析实验，最终筛选得到适用于目标蛋白的亲和仿生配基。蛋白晶体解析技术的快速发展和计算机分子模拟技术的不断进步，也为设计新型的亲和仿生配基提供了强有力的技术支撑。通过分子模拟对蛋白结构和潜在的配基结合位点进行分析，采用分子对接和分子动力学模拟等手段设计和筛选出潜在的配基，可以对实验研究进行合理指导，有效降低实验筛选的盲目性，节省研发时间和成本[5]。

抗体是一类重要的生物技术药物，具有特异性高、靶向性强和毒副作用小等优点，应用前景广阔[6]。目前蛋白A亲和层析是抗体分离的平台技术，特异性高，但由于采用蛋白类的生物亲和配基，存在介质成本高、洗脱条件苛刻、配基易脱落等问题[7-8]，因此寻求经济高效的抗体分离新方法具有重要的意义。研究者发现，通过对配基进行理性的设计和筛选，基于小分子化合物的亲和仿生层析在保证高亲和力的同时，可以很好地弥补蛋白A蛋白配基的不足，应用于抗体分离纯化中，可以得到很好的效果。本文将根据近年来国内外亲和仿生配基的研究进展，着重介绍亲和仿生配基的设计、筛选以及在抗体纯化中的应用。

1 亲和仿生配基

生物体内存在一些大分子具有与某些分子产生特异性结合的能力，例如抗原-抗体、酶-底物、激素-受体等。亲和层析正是利用这种特异性结合的能力即亲和性，从复杂的生物样品中纯化目标分子，优缺点都非常明显，专一性强、分离效率高是主要的优点，但由于一般以固定化生物来源的蛋白基团作为功能配基，成本高、不稳定、洗脱条件苛刻。亲和仿生层析就是要在保持亲和层析优点的基础上，改善其缺点。主要特点在于利用一些与目标分子具有一定特异性和亲和力的小分子功能基团作为配基，模拟生物亲和作用，以达到纯化目标分子的目的。亲和仿生层析的作用模式与亲和层析类似[9]，可以分为上样、亲和吸附、洗脱和再生几个过程，但条件控制尤其是洗脱条件相对简单。以抗体的分离为例，理想情况下，亲和仿生配基只能够特异性识别目标抗体，而对其他组分的非特异性吸附很小，因此经过一次层析分离即可从复杂料液中获得高纯度的抗体产品。

亲和仿生层析的关键在于合适的配基，理想的亲和仿生配基应该具备以下几个特点：配基能够与目标蛋白可逆结合，具有足够的亲和力和选择性；配基易于获得，并易于固定化于层析基质成为亲和仿生层析介质；配基对层析操作条件具有足够的生物和化学稳定性，不易被降解，也不易脱落而造成产品的污染；配基与目标蛋白的结合常数不能太高以保证目标蛋白和配基能够在相对温和的条件下解离。以上这些特点仅是对亲和仿生配基的一般性要求，而实际应用过程中由于目标蛋白的种类繁多，立体结构和理化性质不尽相同，因此针对某种特定的目标蛋白，必须开发相适应的仿生配基。

根据仿生配基的组成，目前主要有化学合成配基和短肽仿生配基两种。

1.1 化学合成仿生配基

通过化学方法合成亲和仿生配基，要求分子量相对较小，与目标蛋白具有一定的亲和性，并能够以共价键的方式偶联到基质上。目前适用于蛋白层析分离的化学合成配基并不多，主要分为两类：基于三嗪结构的配基[10-13]，多组分反应合成的配基[14-15]。

三嗪类仿生配基可以通过三氯代三嗪与3种不同的化学取代基的反应获得，这种取代反应受到温度的调控。其中3种取代基可以直接从基本胺类物质中选择，也可以通过分子模拟做初步筛选[16]。通常在低温下将三氯代三嗪偶联到氨基活化的层析基质上，保留两个取代位点；进一步与具有目标蛋白具有亲和性的另外两个取代基进行反应，见图1。

三嗪类化合物的合成路径需要多步，反应温度在0～90℃变化，苛刻的反应条件限制了配基合成过程的放大。Ugi等[17]提出了四组分合成反应的概念，通过一步化学合成法就可以得到仿生配基。四组分包括乙醛（作为活化基质的一部分）、羧基化合物、伯胺以及异腈结构，如图2所示[18]。配基以乙醛功能化的基质为中心，羧基化合物、伯胺和异腈结构则具有多样性，针对特定目标蛋白可以筛选特异性的取代基，从而实现亲和结合。

与传统反应相比，多组分反应具有一些突出的优点[17, 19-20]。首先，多种组分共同参与反应，每种组分的结构变化将形成配基结构的多样性；其次，快速的化学取代过程可以在相对较短的时间内提高仿生配基的设计空间；最后，多组分反应通过“一步法”完成，可以有效节省时间和试剂用量，简化中间产物的分离操作，可以考察多种化合物，也给过程放大带来便利。

1.2 短肽仿生配基

短肽化合物以氨基酸作为原料，通过设计、筛选和优化可以保证与目标蛋白的亲和性，又具有一定稳定性和很好的生物相容性，非常适合作为仿生配基应用于高附加值生物活性物质的分离纯化。以短肽化合物作为新型的亲和仿生配基，可以突破一些传统配基的局限性，成为近年来的研究热点[21-24]。

1986年，Geysen等[25]指出：含关键氨基酸残基的短肽可以模拟蛋白上的决定簇；多数情况下，短肽与目标蛋白结合的相互作用力主要由关键残基的非共价作用提供，这两个观点奠定了短肽配基的理论基础。短肽配基通常由8～10个氨基酸残基组成，一方面可以避免分子内部折叠，降低短肽合成的难度；另一方面即使配基从固定相上脱落渗入产品中，也不会引起免疫中毒反应，且很容易从最终产品中除去。此外短肽配基与蛋白的作用条件温和，有利于洗脱条件的控制，避免目标蛋白的变性；具有与生物亲和配基类似的亲和力，同时构象和理化性质则更为稳定，能够耐受层析分离中较强的再生条件。

短肽固相合成技术的建立和短肽合成方法的成熟极大地提高了人工合成多肽的效率，推动了组合肽库和短肽仿生配基筛选的发展。图3是组合肽库的构建方法[18]，短肽合成的循环次数是由构成短肽的氨基酸数量所决定，肽库中的短肽配基数目取决于短肽的长度以及所用氨基酸的数目。若以天然氨基酸作为原料，构建的组合肽库中短肽配基数目可达百万，若引入非天然氨基酸，则短肽配基库又会得到进一步的扩大，从而显著增加了配基筛选的难度。因此，最好的方法就是在构建组合肽库时，对氨基酸的种类有所选择，实现仿生配基的理性设计，限制待筛选配基库的大小。

2 仿生配基的理性设计

无论是化学合成配基还是短肽配基，构成配基的功能基团或者氨基酸残基的种类都很多，理论上可能出现上亿种组合，随机选择的效率很低，因而采用理性设计方法，构建一个合理的配基库是十分必要的。基于蛋白结构解析技术的快速发展，研究者可以获得高精度的蛋白空间结构信息，为计算机辅助配基设计提供了基础。计算机分子模拟技术也在不断进步，可以从蛋白的高级结构入手，研究蛋白和配基之间的相互作用，为设计新型的仿生亲和配基提供了有效的技术支持。通过分子模拟对蛋白结构和潜在的配基结合位点进行分析，采用分子对接和分子动力学模拟等手段优化配基结构，可以有效降低实验的盲目性，节省实验成本，提高研发效率[5]。计算机辅助配基设计，一般可以从两个方面入手：一是分析已有天然配基和目标蛋白的结合模式，以天然配基活性位点的关键残基作为模板进行理性设计；二是针对目标蛋白表面潜在的活性部位，设计与其结构互补的化合物作为仿生配基[26]。

2.1 模拟天然配基结构的理性设计

蛋白的生物学功能依赖于其与其他分子的相互识别和相互作用，从而形成具有特殊功能的复合物。因此，可以通过分析蛋白和天然配基间的结合模式，确定天然配基的关键残基，并以此作为模板设计仿生亲和配基。

Lowe教授课题组借助计算机分离模拟开发了基于三嗪结构和Ugi反应的仿生亲和配基，用于纯化IgG。模拟蛋白A的关键残基Phe132-Tyr133，将三嗪取代基确定为苯丙氨酸和酪氨酸，得到仿生配基ligand22/8[10, 13]，用于单克隆抗体和Fc融合蛋白的分离纯化，取得蛋白A亲和层析相媲美的纯化效果。模拟蛋白L，以苯甲酰胺和丁酸作为取代基，得到仿生配基ligand8/7[11]，用于纯化抗体以及Fab和scFV片段。Platis等[27]也采用类似的方法，模拟包膜蛋白gp41的关键残基，设计并合成了仿生配基4E10lig，用于从转基因烟草中分离HIV单克隆抗体4E10。Maltezos等[28]设计并合成了三嗪类仿生配基4ABS-trz-4ABS，一步层析从转基因玉米中分离单抗2G12。Qian等[29]以蛋白G与IgG的Fc片段特异性结合的热点残基Asn35和Trp43作为模板，设计并合成了以对氨基苯甲酰胺和乙酸作为功能化取代基的亲和仿生配基A2C11l1，该配基与Fc片段的结合模式与蛋白G基本吻合，可以作为纯化抗体的有效手段。Khoury等[30]则模拟蛋白G与IgG的Fab片段结合的热点残基，通过理性设计合成了以氨基苯甲酰胺和羟苯基乙酸作为取代基的亲和仿生配基A2C7l1，计算机模拟结果显示该配基能够与Fab分子的CH1结构域结合，进一步通过电离质谱以及核磁共振得到验证。Khoury等[14]通过模拟促红细胞生成素受体（EPOR）的关键残基Phe93、His114和Glu117，设计得到以组氨酸和琥珀酸作为取代基的仿生配基A9C10I8，一步层析从细胞培养液中分离得到高纯度的重组红细胞生成素。

对于多肽仿生配基，同样可以采用天然配基作为模板进行理性设计，进一步利用分子模拟研究蛋白与配基间的相互作用，优化配基结构和空间分布，得到性能更加优良的多肽配基。Salvalaglio等[31]利用分子动力学模拟详细考察了蛋白A片段B与IgG的Fc片段复合物的作用机制，为蛋白A仿生配基的理性设计提供指导。结果表明，蛋白A和IgG之间主要是通过静电相互作用和范德华相互作用结合；蛋白A上的Gln129、Phe132和Lys154是关键氨基酸残基，对结合起主导作用，同时Tyr133、Leu136、Glu143和Gln151对结合的贡献也比较大。Huang等[32]考察了蛋白A与IgG的结合模式，发现疏水作用占据主导地位，进一步分析表明，蛋白A的关键残基为Phe132、Tyr133、His137、Glu143、Arg146和Lys154，而IgG的关键残基为Ile253、His310、Gln311、Asp315、Lys317、Glu430和Asn434。基于上述结果，Zhao等[33]考虑到6个热点残基的空间分布，通过理性设计构建了一个包含2173个短肽的仿生配基库；利用分子对接筛选得到15个待选配基；通过分子动力学模拟分析15个配基与IgG的作用机制，并将亲和性最高的配基FYWHCLDE成功应用于IgG纯化分离。Tong等[34]采用分子动力学模拟方法，考察了7种结合在抗体保守区域的天然配基与Fc片段的相互作用，发现疏水相互作用是主要驱动力，分析发现天然配基的热点残基均包括色氨酸或酪氨酸，提出了两种不同的结合模式，以及仿生配基选择和空间分布的建议。基于色氨酸结合模式，Tong等[35]设计了色氨酸-氨基苯并咪唑的杂合配基W-ABI，并制备亲和仿生层析介质，对抗体具有高度亲和性，且在温和的条件下可实现有效洗脱，取得理想的收率和纯度。另外，Wang等[36]结合分子对接和分子动力学模拟，研究了新型短肽配基 DAAG 与抗体Fc片段之间的相互作用机制，指出 DAAG 配基以类似三脚架的结合方式作用于 Fc 片段保守结合区域附近，其中静电相互作用与范德华相互作用贡献相当，提出了短肽配基设计时应考虑含疏水芳香环的氨基酸和带正电的精氨酸。

通过模拟天然配基结构来理性设计亲和仿生配基，也存在一定的局限性。分析原因，其一在于蛋白与天然配基的晶体结构有限，且在很多情况下，与目标蛋白存在特异性结合的天然配基未被发现，或是蛋白-配基复合物结构未被解析。其二在于仿生配基的设计往往只考虑模仿天然配基的热点残基，忽视了配基与蛋白之间的空间匹配性，在一定程度上可能造成仿生配基与天然配基的作用位点不一致。

2.2 基于目标蛋白结构的理性设计

在无法得到蛋白-天然配基复合物结构的情况下，可以直接从目标蛋白的高级结构出发，分析潜在的结合位点，设计出与目标蛋白活性位点或暴露于蛋白表面的氨基酸残基互补的亲和配基。

Sproule等[37]通过同源建模的方法构建出重组人胰岛素前体（MI13）的三维结构，以其表面的疏水特征区域作为目标结合位点，设计仿生亲和配基，构建了含66个基于三嗪结构的配基库，从中筛选得到与MI13具有较强亲和力的配基ligand2/2，取代基为两个氨基萘醇，成功实现酿酒酵母细胞发酵液中纯化MI13。Baumann等[38]以猪胰腺a淀粉酶（PPA）的催化活性位点作为靶点，通过理性设计构建了一个含53个潜在配基的仿生配基库，利用分子对接和实验相结合进行筛选，得到了配基G5-A33；进一步偶联于琼脂糖凝胶制备仿生介质，发现可以通过PPA抑制剂实现PPA的洗脱，证实了该配基确实结合于PPA的活性中心。Carredano等[39]以人IgG κ-Fab片段的CH1和CL间的保守口袋区域作为靶点，设计并计算机虚拟筛选得到249个待选配基，进一步结合饱和转移差谱NMR（STD-NMR）和表面等离子体共振（SPR）手段进行二次筛选，最后得到了3个高特异性的仿生亲和配基。Liu等[40]以组织型纤溶酶原激活物t-PA的表面口袋结构作为靶点，理性设计并通过分子对接筛选得到了一种四肽仿生配基QDES，通过分子模拟证明了配基通过静电相互作用以及氢键与t-PA相结合，偶联配基制备仿生介质，可以从猪心提取液中纯化t-PA。

基于目标蛋白结构的理性设计方法高度依赖于对目标蛋白结构的认知，根据目标蛋白的结构参数，设计出有利于与目标蛋白作用的仿生配基，并通过实验验证和后续结构优化以提高性能。当无法得到目标蛋白的晶体结构时，则可通过同源建模方法构建蛋白结构，也已应用于配基的理性设计。

3 仿生配基的筛选技术

不管是基于天然配基还是目标蛋白结构的理性设计，都可以得到相对适合目标蛋白的潜在配基，构建一个合理的配基库，大大降低仿生配基库的容量大小。为了得到更为合适的仿生配基应用于实际分离，还必须对潜在配基进行进一步的筛选。配基设计和筛选过程，既要关注配基与目标蛋白的特异性结合，同时还要兼顾蛋白与配基的解离条件，避免蛋白活性发生变化。目前比较成熟的筛选方法有组合化学法、噬菌体展示法以及计算机辅助法。

3.1 组合化学技术

组合化学是一种化学合成策略和筛选方法，最大的优势在于能够在短时间内合成大量的化合物，构建组合库，从而实现具有某种物理、化学性质或生物活性的化合物的快速筛选[26]。组合化学技术在新材料、药物、催化剂等领域有着广泛的应用，也可作为筛选化学合成和短肽仿生配基的有利工具之一。

利用组合化学高通量筛选仿生层析介质如图4所示，一般包括以下步骤[41]：（1）构建组合化学库，选择合适的小分子化合物或氨基酸作为配基偶联到固定相上；（2）初步筛选，目标蛋白用荧光染料或生物素标记，利用目标蛋白和备选化合物之间亲和性的差别进行筛选，与目标蛋白结合较好的化合物可作为阳性配基；（3）鉴定化合物序列，利用HPLC/MS、MALDI-TOF-MS等方法对阳性配基进行解析和鉴定；（4）配基合成、偶联和评估，利用固相法合成仿生配基，偶联到合适的层析基质上，考察目标蛋白的吸附和分离性能；（5）应用验证，仿生介质应用于实际分离体系，验证分离效果。

由于化学合成配基和短肽配基的构成单元有所差别，组合化学库的筛选策略也有所差异[18]。对于化学合成仿生配基，一般采用离散实验法。将偶联待筛选配基的固相分散在96孔板中，在不同液相条件下与目标蛋白样品进行平行的吸附实验，挑选出高效结合目标蛋白的配基进行后续测序分析。Saraswat等[42]详细描述了96孔板平行实验法从组合化学库中筛选特异性结合人血清白蛋白HSA的配基过程。Teng等[16]利用组合化学对含88个与IgG结合的候选配基库进行筛选，得到了仿生配基ligand 22/8，可以将IgG从人血浆中高效分离出来。Roque等[11]通过理性设计和组合化学相结合，获得蛋白L的仿生配基ligand8/7，可以从hIgG的木瓜蛋白酶水解液中分离Fab片段。Haigh等[15]研究多组分Ugi反应合成仿生配基时，也是采用组合化学法对取代基进行筛选。

短肽配基库的高通量筛选不仅可以采用离散实验法，也可以用“分割和重组”法。具体步骤如下：首先将偶联待筛选配基的固定相与目标蛋白在特定的缓冲液体系中进行吸附反应；然后将固定相与能够和目标蛋白发生免疫反应的标记抗体反应，进行免疫染色；依据免疫染色结果筛选出固定相，并将目标蛋白和标记抗体洗脱；最后进行配基测序分析。该方法虽然快速有效，但可能会出现一些假阳性结果，后续进行了一些改良，如采用酶或荧光物质标记的目标蛋白与固定相发生反应[43]、采用两种颜色的标记物进行标记[44]或采用正交染色法[45]，可以显著减少假阳性结果的产生。Kaufman等[46]以人血纤维蛋白原为目标蛋白，采用免疫染色技术从短肽库中筛选获得亲和仿生配基FLLVPL。Gurgel等[47]利用组合化学筛选α-乳白蛋白的六肽仿生配基WHWRKR[48]。Yang等[49]针对IgG的Fc片段构建了一个N端开始依次为组氨酸-芳香族氨基酸-碱性氨基酸的六肽库，利用组合化学进行三轮筛选，得到了特异性结合Fc片段的六肽配基HWRGWV，具有广谱的抗体识别能力，可以应用于乳清、脱脂牛奶和牛初乳中纯化IgG以及细胞培养液中纯化IgG和IgA[23, 50-51]。

组合化学法应用于配基高通量筛选的优势在于：固相合成时，液相反应物过量可以促使反应完成，操作简单，终产物收率高。但也存在一定的局限性，如反应的溶剂受到限制，化学合成过程的条件优化较为复杂，且必须通过构建大库容、高质量的随机组合库来实现其多样性，在实际工作中往往比较费时费力。

3.2 噬菌体展示技术

噬菌体展示技术是一种利用生物技术手段快速构建随机多肽库的方法。基本原理是将一段编码多肽的随机基因片段插入噬菌体基因，并与噬菌体外壳蛋白进行融合表达，利用噬菌体能够大量复制的特点，从而快速得到外壳含不同多肽的噬菌体展示库[41]。一般可以通过降解DNA链或直接将某个基因的全部序列随机插入，从而得到一个噬菌体展示多肽库。

插入基因所表达的多肽一般呈线性展示在噬菌体的表面，然后可以利用目标蛋白对噬菌体展示库进行筛选。目标蛋白选择性地与外源肽结合，分离出含目标多肽的噬菌体，经过3～5轮的“吸附-洗脱-扩增”筛选，可以使含有高亲和力多肽的噬菌体高度富集，最后合成该目标多肽，考察蛋白吸附性能[52]。利用噬菌体展示技术进行肽库筛选的优势在于筛选容量大，且利用噬菌体快速增殖的特性可实现目标多肽的快速富集。Cwirla等[53]利用噬菌体展示技术，构建了一个可结合抗体和其他受体的多肽库，成千上万的六肽表达在噬菌体表面，筛选出高效结合单克隆抗体3-E7的多肽。经过三轮筛选，得到了51个多肽配基，化学合成其中6种，测得单抗3-E7的结合常数在0.35~8.3 μmol·L-1之间。Huang等[54]针对人血浆中糖蛋白vWF，利用噬菌体展示技术筛选得到了特异性结合的多肽配基RVRSFY，发现仿生介质与vWF之间通过静电和疏水相互作用结合。Gaskin等[55]基于丝状噬菌体M13构建了一个七肽配基库，筛选出脂肪酶的亲和配基，通过ELISA法确定亲和性最好的配基，偶联到琼脂糖凝胶制备仿生介质，但纯化效果并不十分理想，表明七肽与脂肪酶之间的亲和力不仅与多肽序列有关，也可能与噬菌体的外壳蛋白相关。Ehrlich等[56]以人源抗Tac单克隆抗体（HAT）作为目标蛋白，利用噬菌体展示技术筛选与其保守区域具有亲和性的多肽配基，构建了七肽库和十二肽库，进行四轮高通量筛选，并根据蛋白A同源性的高低程度进行排序，得到了5种多肽配基，发现EPIHRSTLTALL短肽仿生介质效果最好。

噬菌体展示技术可以作为多肽库的高通量筛选手段，不过也存在着一些缺点[52]。例如，宿主细胞对于多肽具有一定的选择性，一些亲和性好的多肽可能由于对宿主生长不利或者具有毒性而被排除；筛选的多肽在游离状态时对目标蛋白的生物活性下降或消失；筛选多肽难以偶联到基质等。

3.3 计算机辅助筛选技术

针对目标蛋白，无论是组合化学还是噬菌体展示，都是基于实验的高通量筛选手段，工作量巨大。一些学者探讨借助计算机辅助手段进行虚拟筛选，具有不消耗实验耗材、节省人力和时间成本等优势。近年来，计算机性能不断提高，分子模拟技术飞速发展，研究者可以从原子尺度来研究分子间相互作用模式，探讨结合过程中作用力和结构的变化，从而为仿生配基的筛选提供了新的途径。目前常用的方法包括分子对接和分子动力学模拟。

分子对接基于分子间的空间匹配和能量匹配，预测两个或多个分子间的识别过程，广泛应用于研究小分子与大分子间相互作用、生物大分子识别和药物设计等领域。根据配体-受体的简化程度和方式，可以分为刚性对接、半柔性对接和柔性对接3种，其中半柔性对接兼顾了计算量和预测能力，应用较为广泛。常用分子对接软件包括DOCK、Autodock、LUDI、GOLD、FlexX、LigandFit、Glide和ICM-Dock等[5]。分子动力学模拟以牛顿经典力学为基础，通过数值求解的方式来描述体系的运动方式，模拟体系随时间的动态演化过程，在生物大分子结构和功能研究领域得到广泛应用。根据分子力场的简化程度，可以分为全原子力场、联合原子力场以及粗粒化力场3种，主要有AMBER、CHARMM、GROMACS、GROMOS和MARTINI等力场[5]。分子动力学模拟可以计算蛋白与配基之间的相互作用能，从而评价二者间是否存在特异性结合。由于蛋白分子量较大，分子动力学模拟的计算量大，耗时长，通常需要与一些高通量的筛选方法（如分子对接等）结合使用，利用分子对接进行初筛，然后采用分子动力学模拟开展精确验证。

对于化学合成的仿生配基来说，潜在的功能取代基的数目巨大，采用计算机辅助手段对取代基进行筛选，可以大大减少工作量。Li等[13]研究了蛋白A和IgG的Fc片段间的特异性识别位点，设计了一系列三嗪类仿生配基，利用分子对接进行筛选，得到了一个能够与蛋白A竞争的仿生配基ApA，与IgG的结合常数为105～106L·mol-1。Feng等[57]利用分子对接，从200个类似于蛋白A活性位点结构的化合物库中筛选出了一个仿生配基-cbz-L-Tyr，与IgG的结合常数为4.91×106L·mol-1。Qian等[29]利用多组分Ugi反应合成蛋白G仿生配基时，基于蛋白G和鼠源IgG1的Fab片段结合区域的X射线晶体结构，理性设计一些潜在的功能取代基，将配基与Fab片段进行分子对接，筛选得到了A2C7l1仿生配基，可以从哺乳动物或者酵母细胞培养液中纯化得到IgG和Fab片段。

计算机辅助技术也被应用于短肽仿生配基的筛选。Liu等[58]使用柔性对接，对理性设计的多肽配基库进行筛选，建立了一个可以评价多肽配基与目标蛋白之间亲和力的打分函数，由分子对接计算Dscore值直接用于评价亲和力。基于α-淀粉酶，筛选得到六肽配基FHENWS，表观结合常数为2.5×105L·mol-1，偶联FHENWS六肽配基制备仿生介质，实现从谷草芽孢杆菌粗发酵液中分离α-淀粉酶。Liu等[40]利用分子对接和分子动力学模拟相结合的手段，筛选得到了针对组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）的短肽配基。首先构建了一个含14个四肽的短肽配基库，在目标蛋白的待定结合口袋进行分子对接，评价配基与目标蛋白的亲和性，筛选得到了高亲和性的四肽配基QDES，进一步利用分子动力学模拟验证QDES-t-PA复合物的结合稳定性。偶联QDES配基于琼脂糖凝胶，通过一步层析从猪心提取液中分离得到纯度较高的t-PA。Aghaee等[59]也利用分子对接和分子动力学模拟相结合，筛选得到人血清白蛋白的短肽配基。基于HSA的待定结合口袋建立一个短肽配基库，采用分子对接进行筛选，计算二肽与HSA之间的亲和力，筛选得到二肽配基Trp-Trp，在尾部添加空间臂Lys[CO(CH2)5NH]，进一步进行分子对接，并对配基-蛋白复合物进行分子动力学模拟，结果表明配基与蛋白可以实现紧密结合。

4 亲和仿生层析在抗体分离纯化中的应用

抗体是一类重要的生物技术药物，亲和仿生层析作为一种新型的生物分离技术，因其价格相对低廉、结构稳定、特异性较高、纯化过程更易于控制等优点，在抗体纯化中表现出良好的应用前景。针对特定抗体，可以通过计算机辅助技术和实验研究相结合的方法，得到高度亲和与特异性的仿生亲和配基。

4.1 化学合成配基

4.1.1 三嗪类仿生配基

三嗪类化合物作为重要的化学合成仿生配基，已成功用于抗体的分离纯化，表1列举了近年来用于抗体分离的三嗪类仿生配基。剑桥大学Lowe教授课题组[10-13, 15-16]在该方面做了大量工作，通过分子模拟等手段大大缩小了相关胺类物质的筛选范围。Li等[13]以蛋白A作为模板，设计了基于三嗪类的仿生配基。通过分析蛋白A与IgG-Fc片段复合物的晶体结构，确定二者间的特异性识别位点，用计算机辅助分子模拟手段设计了一系列仿生配基。其中以关键残基Phe132-Tyr133二肽作为模板设计仿生配基Ligand 22/8，将其偶联到琼脂糖基质上用于分离血浆中的抗体，吸附容量可达到50 mg·g-1以上，抗体收率大于60%，纯度大于92%，且该介质可以在1 mol·L-1NaOH中保存7 d[10]。基于该配基的商业化介质MabSorbent A1P，已应用于单克隆抗体和Fc融合蛋白的分离纯化，可以达到蛋白A亲和层析的效果。另一种衍生的商业化仿生介质MabSorbent A2P，以-氨基苯酚/-氨基苯酚双取代三嗪作为功能化配基，也可以达到很好的抗体分离效果[60-62]。

表1 用于抗体分离的三嗪类仿生配基 Table 1 Triazine-based biomimetic ligands for antibody separation

Roque等[11]以蛋白L作为模板，利用理性设计和组合化学的方法设计了仿生配基Ligand 8/7，用于纯化抗体以及Fab和scFV片段，可以从hIgG的木瓜蛋白酶降解液中分离Fab片段，纯度达97%。Platis等[27]和Maltezos等[28]则分别针对抗HIV的单克隆抗体4E10和2G12，设计并合成了三嗪类仿生配基4E10lig和4ABS-trz-4ABS，采用一步层析从转基因烟草和转基因玉米中分离单抗。

Telma等[67]利用一种更为绿色简单的方法合成了仿生配基TPN-BM，解决了Ligand22/8配基的溶解限制。以醚键替换了传统三嗪仿生配基中取代基与三嗪核心结构间的氨基结构，配基合成反应温度控制在0℃，催化剂也更为绿色安全。将配基偶联到壳聚糖整体柱上，吸附容量高达160 mg·g-1，从哺乳动物细胞培养液中捕获单抗，收率达85%，纯度高达98%。

4.1.2 多组分反应合成的配基

Lowe教授课题组[15, 29-30]开发了多个Ugi反应合成的仿生配基，应用于抗体的分离纯化，配基结构如表2 所示。Haigh等[15]针对抗体构建了一个由多个伯胺、羧酸和异腈组成的化合物库，结合计算机辅助手段和层析过程筛选，采用Ugi反应合成了一种蛋白L的仿生配基A3C1I1，偶联于琼脂糖凝胶制备仿生亲和介质，发现配基可以特异性地与IgG的Fab片段结合，而不与Fc片段发生作用，Fab片段的静态吸附容量约16.6 mg·g-1，亲和常数为2.6×10-6mol·L-1。Qian等[29]通过Ugi反应合成了一种仿生配基A2C11I1，模拟蛋白G的Asn35和Trp43，与来源于人、牛、羊、鼠、猪、兔血清的IgG、鸡血清IgY以及重组骆驼Fc结构域均有较好的亲和性。Khoury等[30]也采用Ugi反应合成了蛋白G的仿生配基A2C7I1，分子模拟分析表明配基与IgG的Fab片段的结合位点在CH1区域，偶联A2C7I1配基制备仿生介质，从哺乳动物细胞培养液中纯化IgG和Fab片段，收率达99%，纯度93%。

表2 Ugi反应合成的仿生配基 Table 2 Biomimetic ligands synthesized by Ugi reaction

4.2 短肽仿生配基

近年来应用于抗体分离纯化的短肽仿生配基如表3所示，主要包括多聚肽、线性肽以及环肽配基。

表3 用于抗体分离的短肽仿生配基 Table 3 Peptide-based biomimetic ligands for antibody separation

4.2.1 多聚肽配基

Fassina等[69]通过筛选多聚肽库，得到可以特异性识别IgG的Fc片段的多聚肽，命名为TG19318。合成过程可以在溶液或固相中进行，产率高而成本较低，该配基与IgG的亲和常数接近0.3 μmol·L-1[70]，吸附容量略低于蛋白A配基，不过可特异性结合的抗体种类更为广泛，可以用于不同动物的血清和哺乳动物细胞培养液中分离IgG，以及卵黄中分离IgY，纯度均在95%以上[71]。Palombo等将TG19318配基用于从细胞培养液和血清中分离IgA[72]，腹水中分离IgE[73]，血清、腹水、细胞培养液中分离IgM[74]，均取得了良好的分离效果。Verdoliva等[75]进一步对配基进行了改造，采用非天然D型氨基酸取代所有的天然氨基酸，发现D-PAM功能化的仿生介质可以直接从血清中捕获IgG，收率为60%～90%，纯度90%。与蛋白水解酶接触1 h后，水解比例小于10%，说明D-PAM配基既保持了PAM与抗体结合的特异性，又提高了对蛋白酶的耐受性。

4.2.2 线性肽配基

Carbonell教授课题组对线性短肽配基进行了深入研究，在介质的吸附性能（静态和动态吸附能力）、不同分离对象（动物血清、细胞培养液、乳清等）、配基-抗体相互作用机理等方面均有报道。Yang等[49]设计了以组氨酸作为N端、包含芳香族和带正电氨基酸残基的六肽组合化学库，通过三次筛选得到了能够特异性识别IgG-Fc片段的六肽配基HWRGWV，对Fc片段的选择性与蛋白A相仿，从哺乳动物细胞培养液中捕获hIgG，纯度和收率均可达到95%[21]。研究表明，HWRGWV六肽配基与IgG的结合位点与蛋白A/蛋白G并不一致，质谱和分子对接分析表明HWRGWV结合位点在pFc区域，与CH3域的Ser383-Asn389环发生作用[22]。以六肽HWRGWV作为功能配基，偶联于层析基质制备仿生介质，经基质改造和层析过程优化，实现从CohnⅡ+Ⅲ组分中纯化IgG、IgA和IgM，乳清、脱脂牛奶和牛初乳中纯化IgG，以及细胞培养液中纯化IgG和IgA[23, 50-51]。值得关注的是，Menegatti等[24]通过介质表面化学改性，避免配基偶联时酯键的形成，制备出耐碱的HWRGWV六肽仿生介质，经过200次0.1 mol·L-1NaOH再生循环，IgG收率从91%下降到85%，而纯度保持在95%左右。

Sugita等[76]通过考察IgG-Fcγ受体与Fc片段的相互作用，采用点合成多肽阵列技术合成了两种亲和力较强的八肽配基NKFRKYK和NARKFYKG，与IgG-Fc的亲和常数分别为8.9×106L·mol-1和6.5×106L·mol-1，不过从细胞培养液中分离IgG和Fc片段时，纯度分别仅为83%和68%。

Zhao等[33, 77]以蛋白A与IgG-Fc片段具有特异性结合的6个热点残基（F132、Y133、H137、E143、R146和K154）为基础，引入半胱氨酸作为配基偶联残基，并充分考虑热点残基的空间距离等因素，将19种氨基酸插入到热点残基中，构建了一个多肽库；采用分子对接和分子动力学模拟的方法，筛选出3种八肽配基FYWHCLDE、FYCHWALE和FYCHTIDE，均可以有效地将hIgG从血浆和细胞培养液中分离出来。其中FYWHCLDE配基的吸附容量最大，分离性能最优。Zhao等[78]进一步将FYWHCLDE配基偶联到琼脂糖凝胶上，制备了不同配基密度（10.4～30.1 μmol·ml-1）的八肽仿生介质，考察配基密度对IgG静态和动态吸附的影响，结果表明随着配基密度的增大，静态吸附容量和动态载量均有明显提高。此外，Zhao等[79]还将3种八肽配基两两混合偶联到基质上，制备了3种双配基亲和体系，发现与单配基体系相比，双配基体系存在协同增强效应，与hIgG的亲和力更强。

4.2.3 环肽配基

Menegatti等[80]开发了一种新型的环肽配基cyclo[-M-WFRHY-K]，能够特异性地结合IgG的Fc片段，而不结合Fab片段，对IgG的吸附容量和解离常数分别为19.7 mg·ml-1和7.6×10-6mol·L-1，应用于从CHO细胞培养液中分离IgG1和IgG4时，可在更温和的条件（pH4）下实现洗脱，收率和纯度分别为96%和93%。结果表明，相对于线性肽，环肽配基具有更加合理的空间分布，对抗体具有更强的亲和力和特异性，且对蛋白水解酶的耐受性更好。

综上可见，由于结合组合化学和分子模拟等方法，仿生配基的设计和筛选效率得到了很大的提高，出现了一系列成功应用于抗体分离纯化的仿生配基。然而，值得注意的是仿生配基的合成方法还比较单一，还未能适应抗体结构复杂性的要求，使其整体结构受到了限制，很难像天然生物配基那样实现与抗体在空间结构上的完美匹配，因此选择性低于生物配基。

5 总结与展望

亲和仿生层析是一种新型的生物分离技术，可用于生物活性物质的分离纯化，尤其在抗体纯化中表现出良好的前景。亲和仿生配基既具备了小分子配基价格低廉、结构稳定、清洗方便等优点，又显著提高了抗体结合的特异性，分离过程易于控制，显现出良好的应用潜力。

目前应用比较广泛的两种亲和仿生配基是化学合成仿生配基和短肽仿生配基，前者具有合成较为简单、种类多样等优点；后者以氨基酸残基作为原料，生物相容性好，与目标蛋白的亲和性高。无论是化学合成配基还是短肽配基，构成配基的功能基团或者氨基酸残基的种类都很多，随机选择的效率很低，因而采用理性设计方法，构建一个合理的配基库是十分必要的。基于蛋白结构解析的快速发展和计算机分子模拟技术的不断进步，可以利用计算机辅助技术对仿生配基进行理性设计，包括模拟天然配基和基于目标蛋白结构的理性设计。在理性设计的配基库基础上，针对特定分离对象，通过高通量的筛选，最终得到合适的仿生配基。目前比较成熟的筛选方法有组合化学法、噬菌体展示法以及计算机辅助筛选。鉴于仿生配基设计和筛选的复杂性，充分结合计算机辅助技术和实验研究方法，可以提高研发效率，得到高度亲和力和特异性的仿生亲和配基。

针对抗体分离的仿生配基设计和筛选，可以采取如下策略：首先根据抗体结构的特点，分析特征结合部位，利用分子模拟对配基进行理性设计，构建一个仿生配基库，采用高通量方法进行筛选，得到为数不多的潜在配基；合成潜在配基，实验分析配基-抗体相互作用，验证配基与目标蛋白间的亲和性，或者偶联配基制备仿生介质，通过亲和层析进一步筛选，得到特异性结合的仿生亲和配基；对仿生亲和介质的性能（如介质孔径、配基密度、空间臂等）以及层析过程进行优化，应用于实际分离体系。亲和仿生层析已在抗体分离纯化中得到了成功应用，相信随着相关技术的不断进步，越来越多的目标蛋白将可以“定制”仿生配基，实现高效的亲和仿生层析分离。

References

[1] SERPA G, AUGUSTO E F P, TAMASHIRO W M S CEvaluation of immobilized metal membrane affinity chromatography for purification of an immunoglobulin G1 monoclonal antibody [J].Journal of Chromatography B Analytical Technologies in the Biomedical & Life Sciences, 2005, 816 (1/2): 259-268.

[2] ZIMMERMAN T, FRERE C P, SATZGER MSimultaneous metal chelate affinity purification and endotoxin clearance of recombinant antibody fragments [J].Journal of Immunological Methods, 2006, 314 (1/2): 67-73.

[3] LOWE C R,PEARSON J C. Affinity chromatography on immobilized dyes [J].Methods in Enzymology, 1984, 104 (104): 97-113.

[4] CLONIS Y D, LABROU N E, KOTSIRA V PBiomimetic dyes as affinity chromatography tools in enzyme purification [J].Journal of Chromatography A, 2000, 891 (1): 33-44.

[5] 童红飞. 新型疏水性电荷诱导配基设计及层析分离抗体研究[D]. 杭州：浙江大学, 2014: 18-22.
TONG H F. Antibody separation by hydrophobic charge-induction chromatography and novel ligand design [D]. Hangzhou：Zhejiang University, 2014: 18-22.

[6] MURAD J P, LIN O A, PAEZ ESPINOSA E VCurrent and experimental antibody-based therapeutics: insights, breakthroughs, setbacks and future directions [J].Current Molecular Medicine, 2013, 13 (1): 165-178.

[7] SHUKLA A A, HUBBARD B, TRESSEL TDownstream processing of monoclonal antibodies—application of platform approaches [J].Journal of Chromatography B, 2007, 848 (1): 28-39.

[8] LOW D, O’LEARY R,PUJAR N S. Future of antibody purification [J].Journal of Chromatography B Analytical Technologies in the Biomedical & Life Sciences, 2007, 848 (1): 48-63.

[9] ROQUE A C, SILVA C S,TAIPA M Â. Affinity-based methodologies and ligands for antibody purification: advances and perspectives [J].Journal of Chromatography A, 2007, 1160 (1): 44-55.

[10] SU F T, SPROULE K, HUSAIN AAffinity chromatography on immobilized “biomimetic” ligands. Synthesis, immobilization and chromatographic assessment of an immunoglobulin G-binding ligand [J]. Journal of Chromatography B Analytical Technologies in the Biomedical & Life Sciences, 2000, 740 (1): 1-15.

[11] ROQUE A C A, ÂNGELA T M,LOWE C R. Synthesis and screening of a rationally designed combinatorial library of affinity ligands mimicking protein L from[J].Journal of Molecular Recognition, 2005, 18 (3): 213-224.

[12] ROQUE A C A, TAIPA M Â,LOWE C R. An artificial protein L for the purification of immunoglobulins and Fab fragments by affinity chromatography [J].Journal of Chromatography A, 2005, 1064 (2): 157-167.

[13] LI R, DOWD V, STEWART D JDesign, synthesis, and application of a protein A mimetic [J].Nature Biotechnology, 1998, 16 (2): 190-195.

[14] KHOURY G E, WANG Y, WANG DDesign, synthesis, and assessment of aaffinity adsorbent for the purification of recombinant human erythropoietin [J].Biotechnology & Bioengineering, 2013, 110 (11): 3063-3069.

[15] HAIGH J M, HUSSAIN A, MIMMACK M LAffinity ligands for immunoglobulins based on the multicomponent Ugi reaction [J].Journal of Chromatography B Analytical Technologies in the Biomedical & Life Sciences, 2009, 877 (14/15): 1440-1452.

[16] TENG S F, SPROULE K, HUSSAIN AA strategy for the generation of biomimetic ligands for affinity chromatography. Combinatorial synthesis and biological evaluation of an IgG binding ligand [J].Journal of Molecular Recognition, 1999, 12 (1): 67-75.

[17] ALEXER D,IVAR U. Multicomponent reactions with isocyanides [J]. Angewandte Chemie, 2000, 39 (18): 3168-3210.

[18] RALD P G, PATRICK S,EGISTO B. The quest for affinity chromatography ligands: are the molecular libraries the right source? [J]. Journal of Separation Science, 2015, 38 (15) 2559-2572.

[19] DOMLING A. Recent developments in isocyanide based multicomponent reactions in applied chemistry [J].Chemical Reviews, 2006, 106 (1): 17-89.

[20] WEBER L, ILLGEN K,ALMSTETTER M. Discovery of new multi component reactions with combinatorial methods [J].Synlett, 1999, 1999 (3): 366-374.

[21] YANG H, GURGEL P V,CARBONELL R G. Purification of human immunoglobulin GFc-specific small peptide ligand affinity chromatography [J].Journal of Chromatography A, 2009, 1216 (6): 910-918.

[22] YANG H, GURGEL P V, WILLIAMS D KBinding site on human immunoglobulin G for the affinity ligand HWRGWV [J]. Journal of Molecular Recognition, 2010, 23 (3): 271-282.

[23] NAIK A D, MENEGATTI S, GURGEL P VPerformance of hexamer peptide ligands for affinity purification of immunoglobulin G from commercial cell culture media [J].Journal of Chromatography A, 2011, 1218 (13): 1691-1700.

[24] MENEGATTI S, NAIK A D, GURGEL P VAlkaline-stable peptide ligand affinity adsorbents for the purification of biomolecules [J].Journal of Chromatography A, 2012, 1245 (13): 55-64.

[25] GEYSEN H M, RODDA S J,MASON T J. A priori delineation of a peptide which mimics a discontinuous antigenic determinant [J].Molecular Immunology, 1986, 23 (7): 709-715.

[26] 任军，贾凌云. 亲和色谱仿生配基的筛选和设计 [J].分析化学, 2005, 33 (9): 1345-1349.
REN J, JIA L Y. Screening and design of affinity chromatography biomimetic ligand [J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2005, 33 (9): 1345-1349.

[27] PLATIS D, MALTEZOS A, MA K CCombinatorialdesign and application of a biomimetic affinity ligand for the purification of human anti-HIV mAb 4E10 from transgenic tobacco [J].Journal of Molecular Recognition, 2009, 22 (6): 415-424.

[28] ANASTASIOS M, DIMITRIS P, DIMITRIOS VDesign, synthesis and application of benzyl-sulfonate biomimetic affinity adsorbents for monoclonal antibody purification from transgenic corn [J].Journal of Molecular Recognition, 2014, 27 (1): 19-31.

[29] QIAN J, KHOURY G E, ISSA HA synthetic protein G adsorbent based on the multi-component Ugi reaction for the purification of mammalian immunoglobulins [J].Journal of Chromatography B, 2012, 898 (6): 15-23.

[30] KHOURY G E, LOWE C R. A biomimetic protein G affinity adsorbent: an Ugi ligand for immunoglobulins and Fab fragments based on the third IgG‐binding domain of protein G [J].Journal of Molecular Recognition, 2013, 26 (4): 190-200.

[31] SALVALAGLIO M, ZAMOLO L, BUSINI VMolecular modeling of protein A affinity chromatography [J].Journal of Chromatography A, 2009, 1216 (50): 8678-8686.

[32] HUANG B, LIU F F, DONG X YMolecular mechanism of the affinity interactions between protein A and human immunoglobulin G1 revealed by molecular simulations [J].Journal of Physical Chemistry B, 2011, 115 (14): 4168-4176.

[33] ZHAO W W, LIU F F, SHI Q HBiomimetic design of affinity peptide ligands for human IgG based on protein A-IgG complex [J].Biochemical Engineering Journal, 2014, 88 (28): 1-11.

[34] TONG H F, LIN D Q, ZHANG Q LMolecular recognition of Fc-specific ligands binding onto the consensus binding site of IgG: insights from molecular simulation [J].Journal of Molecular Recognition, 2014, 27 (8): 501-509.

[35] TONG H F, LIN D Q, CHU W NMultimodal charge-induction chromatography for antibody purification [J].Journal of Chromatography A, 2015, 1429: 258-264.

[36] WANG R Z, LIN D Q, TONG H FMolecular insights into the binding selectivity of a synthetic ligand DAAG to Fc fragment of IgG [J].Journal of Molecular Recognition, 2014, 27 (5): 250-259.

[37] SPROULE K, MORRILL P, PEARSON J CNew strategy for the design of ligands for the purification of pharmaceutical proteins by affinity chromatography [J].Journal of Chromatography B Biomedical Sciences & Applications, 2000, 740 (1): 17-33.

[38] BAUMANN H, ÖHRMAN S, SHINOHARA YRational design, synthesis, and verification of affinity ligands to a protein surface cleft [J].Protein Science A Publication of the Protein Society, 2003, 12 (4): 784-793.

[39] CARREDANO E, BAUMANN H, GR NBERG AA novel and conserved pocket of human κ-Fab fragments: design, synthesis, and verification of directed affinity ligands [J].Protein Science, 2004, 13 (6): 1476-1488.

[40] LIU F F, DONG X Y, WANG TRational design of peptide ligand for affinity chromatography of tissue-type plasminogen activator by the combination of docking and molecular dynamics simulations [J].Journal of Chromatography A, 2007, 1175 (2): 249-258.

[41] 王荣柱. 以四肽为配基的仿生层析和抗体的分离纯化 [D]. 杭州：浙江大学, 2015: 14-18.
WANG R Z. Research on tetrapeptide biomimetic chromatography for antibody purification [D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2015: 14-18.

[42] SARASWAT L D, ZHANG H, HARDY L WAffinity ligand selection from a library of small molecules: assay development, screening, and application [J].Biotechnology Progress, 2005, 21 (1): 300-308.

[43] LAM K S, SALMON S E, HERSH E MA new type of synthetic peptide library for identifying ligand-binding activity [J].Nature, 1991, 354 (6348): 82-84.

[44] LAM K S, WADE S, ABDULLATIF FApplication of a dual-color detection scheme in the screening of a random combinatorial peptide library [J].Journal of Immunological Methods, 1995, 180 (2): 219-223.

[45] BUETTNER J A, DADD C A, BAUMBACH G AChemically derived peptide libraries: a new resin and methodology for lead identification [J]. International Journal of Peptide and Protein Research, 1996, 47 (1/2): 70-83.

[46] KAUFMAN D B, HENTSCH M E, BAUMBACH G AAffinity purification of fibrinogen using a ligand from a peptide library [J].Biotechnology & Bioengineering, 2002, 77 (3): 278-289.

[47] GURGEL P V, CARBONELL R G,SWAISGOOD H E. Identification of peptide ligands generated by combinatorial chemistry that bind α-lactalbumin [J].Separation Science & Technology, 2001, 36 (11): 2411-2431.

[48] GURGEL P V, CARBONELL R G,SWAISGOOD H E. Fractionation of whey proteins with a hexapeptide ligand affinity resin [J].Bioseparation, 2000, 9 (6): 385-392.

[49] YANG H, GURGEL P V,CARBONELL R G. Hexamer peptide affinity resins that bind the Fc region of human immunoglobulin G [J].Journal of Peptide Research, 2005, 66 (s1): 120-137.

[50] NAIK A D, MENEGATTI S, REESE H RProcess for purification of monoclonal antibody expressed in transgenic Lemna plant extract using dextran-coated charcoal and hexamer peptide affinity resin [J].Journal of Chromatography A, 2012, 1260 (20): 61-66.

[51] BILLAKANTI J M, FEE C J, NAIK A DApplication of peptide chromatography for the isolation of antibodies from bovine skim milk, acid whey and colostrum [J].Food & Bioproducts Processing, 2014, 92 (2): 199-207.

[52] 黄波. 抗体亲和肽配基的理性设计和色谱表征 [D].天津：天津大学, 2011: 4-18.
HUANG B. Rational design of affinity peptide ligands for antibody and chromatographic characterizations [D]. Tianjin: Tianjin University, 2011: 4-18

[53] CWIRLA S E, PETERS E A, BARRETT R WPeptides on phage: a vast library of peptides for identifying ligands [J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1990, 87 (16): 6378-6382.

[54] HUANG P Y, BAUMBACH G A, DADD C AAffinity purification of von Willebrand factor using ligands derived from peptide libraries [J].Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1996, 4 (5): 699-708.

[55] GASKIN D, STARCK K, TURNER N APhage display combinatorial libraries of short peptides: ligand selection for protein purification [J].Enzyme & Microbial Technology, 2001, 28 (9/10): 766-772.

[56] EHRLICH G K, BAILON P. Identification of model peptides as affinity ligands for the purification of humanized monoclonal antibodies by means of phage display [J].Journal of Biochemical & Biophysical Methods, 2001, 49 (1/2/3): 443-454.

[57] FENG H Q, JIA L Y, LI H LScreening and chromatographic assessing of a novel IgG biomimetic ligand [J].Biomedical Chromatography, 2006, 20 (10): 1109-1115.

[58] LIU F F, WANG T, DONG X YRational design of affinity peptide ligand by flexible docking simulation [J].Journal of Chromatography A, 2007, 1146 (1): 41-50.

[59] AGHAEE E, GHASEMI J B, MANOUCHEHRI FCombined docking, molecular dynamics simulations and spectroscopic studies for the rational design of a dipeptide ligand for affinity chromatography separation of human serum albumin [J].Journal of Molecular Modeling, 2014, 20 (10): 1-13.

[60] GHOSE S, HUBBARD B,CRAMER S M. Evaluation and comparison of alternatives to protein A chromatography mimetic and hydrophobic charge induction chromatographic stationary phases [J].Journal of Chromatography A, 2006, 1122 (1/2): 144-152.

[61] CHHATRE S, FRANCIS R, TITCHENER-HOOKER N JEvaluation of a novel agarose-based synthetic ligand adsorbent for the recovery of antibodies from ovine serum [J].Journal of Chromatography B Analytical Technologies in the Biomedical & Life Sciences, 2007, 860 (2): 209-217.

[62] ZAMOLO L, SALVALAGLIO M, CAVALLOTTI CExperimental and theoretical investigation of effect of spacer arm and support matrix of synthetic affinity chromatographic materials for the purification of monoclonal antibodies [J].Journal of Physical Chemistry B, 2010, 114 (29): 9367-9380.

[63] KABIR S. Immunoglobulin purification by affinity chromatography using protein A mimetic ligands prepared by combinatorial chemical synthesis [J].Immunological Investigations, 2002, 31 (3/4): 263-278.

[64] BRANCO R J F, DIAS A M G C,ROQUE A C A. Understanding the molecular recognition between antibody fragments and protein A biomimetic ligand [J].Journal of Chromatography A, 2012, 1244 (12): 106-115.

[65] SANTANA S D F, DHADGE V L,ROQUE A C A. Dextran-coated magnetic supports modified with a biomimetic ligand for IgG purification [J].ACS Applied Materials & Interfaces, 2012, 4 (11): 5907-5914.

[66] PADILLA S, ALVAREZ T, FERRO WAssessment of synthetic protein-A mabsorbents in antibody purification from tobacco plant extract [J].Chromatographia, 2010, 72 (1/2): 121-125.

[67] BARROSO T, LOUREN O A, ARA JO MA green approach toward antibody purification: a sustainable biomimetic ligand for direct immobilization on (bio)polymeric supports [J]. Journal of Molecular Recognition, 2013, 26 (12): 662-671.

[68] BARROSO T, BRANCO R J F, AGUIAR-RICARDO AStructural evaluation of an alternative protein A biomimetic ligand for antibody purification [J].Journal of Computer-Aided Molecular Design, 2014, 28 (1): 25-34.

[69] FASSINA G, VERDOLIVA A, ODIERNA M RProtein A mimetic peptide ligand for affinity purification of antibodies [J].Journal of Molecular Recognition, 1996, 9 (5/6): 564-569.

[70] FASSINA G, RUVO M, PALOMBO GNovel ligands for the affinity-chromatographic purification of antibodies [J].Journal of Biochemical & Biophysical Methods, 2001, 49 (1/2/3): 481-490.

[71] FASSINA G, VERDOLIVA A, PALOMBO GImmunoglobulin specificity of TG19318: a novel synthetic ligand for antibody affinity purification [J].Journal of Molecular Recognition, 1998, 11 (1-6): 128-133.

[72] PALOMBO G, FALCO S D, TORTORA MA synthetic ligand for IgA affinity purification [J].Journal of Molecular Recognition, 1998, 11 (1-6): 243-246.

[73] PALOMBO G, ROSSI M, CASSANI GAffinity purification of mouse monoclonal IgG using a protein A mimetic ligand (TG19318) immobilized on solid supports [J].Journal of Molecular Recognition, 1998, 11 (1-6): 247-249.

[74] PALOMBO G, VERDOLIVA A,FASSINA G. Affinity purification of immunoglobulin M using a novel synthetic ligand [J].Journal of Chromatography B Biomedical Sciences & Applications, 1998, 715 (1): 137-145.

[75] VERDOLIVA A, PANNONE F, ROSSI MAffinity purification of polyclonal antibodies using a new all-D synthetic peptide ligand: comparison with protein A and protein G [J].Journal of Immunological Methods, 2002, 271 (271): 77-88.

[76] SUGITA T, KATAYAMA M, OKOCHI MScreening of peptide ligands that bind to the Fc region of IgG using peptide array and its application to affinity purification of antibody [J].Biochemical Engineering Journal, 2013, 79 (2): 33-40.

[77] ZHAO W W, LIU F F, SHI Q HOctapeptide-based affinity chromatography of human immunoglobulin G: comparisons of three different ligands [J].Journal of Chromatography A, 2014, 1359: 100-111.

[78] ZHAO W W, SHI Q H,YAN S. Fywhclde-based affinity chromatography of IgG: effect of ligand density and purifications of human IgG and monoclonal antibody [J].Journal of Chromatography A, 2014, 1355: 107-114.

[79] ZHAO W W, SHI Q H,YAN S. Dual-ligand affinity systems with octapeptide ligands for affinity chromatography of hIgG and monoclonal antibody [J].Journal of Chromatography A, 2014, 1369: 64-72.

[80] STEFANO M, MAHMUD H, AMITH D NmRNA display selection and solid-phase synthesis of Fc-binding cyclic peptide affinity ligands [J].Biotechnology & Bioengineering, 2013, 110 (3): 857-870.

Affinity biomimetic chromatography and its applications for antibody purification

LU Huili, LIN Dongqiang, YAO Shanjing

(Key Laboratory of Biomass Chemical Engineering of Ministry of Education, College of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, Zhejiang, China)

Affinity biomimetic chromatography is a novel bioseparation technology for the biological active substance, particularly showing good performance for antibody purification with the advantages of low cost, stable ligand structure, high specificity and so on. The critical point of affinity biomimetic chromatography is the specially-designed biomimetic ligand. The biomimetic ligands used currently include chemical synthetic ligand and short peptide ligand, which are normally obtained by rational design and screening. For a particular target protein, instead of selecting the ligand randomly, it is necessary to build a reasonable ligand library by rational designing method and screen the suitable mimetic ligand by high-throughput screening technology. According to the recent advances in affinity biomimetic chromatography, the designing and screening of ligands used for affinity mimetic chromatography and the applications in antibody purification are reviewed in the present article.

affinity biomimetic chromatography; chemical synthetic ligand; short peptide ligand; antibody; purification; molecular simulation

supported by the National Natural Science Foundation of China(21576233, 21276228).

2016-02-24.

Prof. YAO Shanjing, yaosj@zju.edu.cn

TQ 028

A

0438—1157（2016）09—3523—13

10.11949/j.issn.0438-1157.20160203

国家自然科学基金项目（21576233，21276228）。

2016-02-24收到初稿，2016-04-28收到修改稿。

联系人：姚善泾。第一作者：卢慧丽(1986—)，女，博士后。