核心蛋白聚糖对翼状胬肉成纤维细胞增殖的影响*

周 清， 郭娴吟， 杨筱曦， 陈 剑△

(1暨南大学附属第一医院眼科，广东广州510632;2东莞石龙人民医院眼科，广东东莞523320)

翼状胬肉是一种常见的多发的眼表疾病，组织学以成纤维细胞异常增殖、胶原大量合成、细胞外基质过度沉积为组织学特点。国内外诸多学者对其发病机制进行了深入的研究，但确切的发病机制目前尚未完全明了。目前明确其病因与太阳光紫外线(ultraviolet rays，UVR)照射有关，通过与之相关的自由基使大分子失活［1］。近10年来，通过分子遗传学技术，对翼状胬肉的发病机制研究收获颇多［2］。药物能在分子水平抑制血管生成及细胞增殖，进而抑制翼状胬肉的生长是目前一个新的研究方向［3－4］。

转化生长因子 β(transforming growth factorβ，TGF－β)在各种类型的纤维化疾病中的过度异常表达可能是引起组织纤维化的重要机制之一，被认为是目前最重要的致纤维化细胞因子之一。研究表明:在翼状胬肉的上皮细胞，血管内皮细胞及基底膜，成纤维细胞均有过量的TGF－β表达，体外培养的翼状胬肉成纤维细胞可被TGF－β促增殖［5］。基于TGF－β在翼状胬肉的发生及反应进程中的重要作用，能特异性地抑制TGF－β生物学活性的物质成为本次研究的首选。而人核心蛋白聚糖(decorin，DCN)正是这样一种物质，它作为一种已知的天然内源性TGF－β阻断剂而具有抗纤维化效果。从上世纪90年代初起，DCN在眼科领域也开展了相关研究，主要集中于角膜的研究［6］。目前，尚未对翼状胬肉进行相关的研究，本实验选择体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞(human pterygium fibroblasts，HPF)作为研究对象，探讨TGF－β抑制剂DCN对其增殖和凋亡的影响，并与传统药物丝裂霉素进行比较，为其用于翼状胬肉的治疗和术后预防复发提供前期实验资料。

材料和方法

1 主要试剂

DCN(R＆D)，丝裂霉素 C(mitomycin C，MMC;华北制药公司)，小鼠抗人角蛋白及波形蛋白单克隆抗体(Santa Cruz)，小鼠抗人增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)单克隆抗体(Santa Cruz)，SABC免疫组化试剂盒(武汉博士德公司)，DAB显色试剂盒(武汉博士德公司)。

2 标本来源

共收集本院15例初发期翼状胬肉患者的手术标本，其中男性9例，女性6例，年龄49～58岁。

3 主要方法

3．1 HPF的原代培养及传代培养 利用组织块培养法采用含200 mL/L小牛血清的DMEM培养基将细胞常规培养于温箱中。待原代贴壁培养生长至基本汇满培养瓶瓶底时用2．5 g/L的胰酶消化，按1∶2继续传代培养，取第3或第4代细胞用于实验。制备细胞爬片，SP法染色进行鉴定。

3．2 DCN及MMC对HPF增殖的影响 在传代至第3或4代的HPF(贴壁24 h后)中加入DCN，并以MMC为对照，10 mg/L培养24 h、48 h及72 h后在相差显微镜下观察细胞分布及形态学变化。吸去上清，各孔加MTT 20μL，孵育4h，加120μL DMSO，振荡后用酶标仪测490 nm处吸光度值(A)。实验组细胞抑制率(inhibitory rate，IR)(%)=(阴性对照组平均A值－处理组平均A值)/阴性对照组平均A值×100%。

3．3 流式细胞术检测DCN对细胞周期分布及凋亡情况 待HPF传代至第3或第4代，取不同浓度的DCN(0．01、0．1、1、5、10 mg/L)分别处理 48 h 后的实验组及对照组(不加药)细胞悬液，每组各4瓶标本，PBS洗涤2次后离心，弃上清，加入70%冷乙醇，吹打成单细胞悬液后加入70%冷乙醇固定过夜，离心后弃上清，PBS洗涤2次，加入0．2 mg/L RNA酶50 mL，放入37℃恒温箱30 min，碘化丙啶(PI)染色，4 h内用FACS－420流式细胞仪(BD)检测，选用488 nm激发波长测定样本。

3．4 检测DCN对细胞表达PCNA的影响 待HPF传代至第3或第4代，将细胞悬液接种于铺有盖玻片(按细胞培养用品清洗和高压灭菌)的6孔板中，孵育24 h后分为A、B 2组，A组为对照组，B组为DCN 组(0．01、0．1、1、5、10mg/L)，孵育 48 h 后取出盖玻片，经免疫组织化学SP法染色(同前)检测PCNA的表达。结果分析采用比较PCNA标记指数(labeling index，LI)，即平均每100个细胞中的阳性细胞数。计算6个视野(放大倍率20×10)的全部阳性细胞及阴性细胞并列表，将计数资料进行χ2检验。

4 统计学处理

采用SPSS13．0软件作统计处理，计量资料用均数±标准差(¯x±s)表示，组间差异性比较用单因素方差分析，细胞数量与吸光度值(A值)关系采用相关分析，以P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1 HPF免疫组织化学鉴定

体外培养的HPF经SP法染色可见波形蛋白表达阳性，位于胞浆，呈现与成纤维细胞长轴方向一致棕黄色束状或网状结构;细胞角蛋白表达阴性，见图1。

2 HPF生长曲线测定

对照组曲线可明显区分为指数增长期(接种后2～6 d)和平台期(6 d以后)，而用药组曲线下移，上升缓慢，趋于低平，无明显的指数增长期和平台期，在用药5～6 d吸光度达峰值，以后逐渐下降，见图2。

3 不同浓度DCN及MMC对HPF的增殖抑制作用

Figure 1．Identification of human pterygium fibroblasts(immunocytochemical staining，×100)．A:positive expression of vimentin;B:negative expression of keratin．图1 人翼状胬肉成纤维细胞的鉴定

Figure 2．Growth curves of human pterygium fibroblasts from day 1 to day 8．¯x±s．n=15．图2 1～8 d人翼状胬肉成纤维细胞的生长曲线

2组药物随浓度增加，其抑制作用增强，并呈剂量依赖性，见表1～3。DCN组不同浓度的抑制率均低于MMC组，尤其是当DCN药物浓度低时，即＜1 mg/L，其抑制作用不明显，当浓度＞1 mg/L时，其抑制作用增强增快。MMC组:随时间的延长，细胞可出现毒性反应，可见细胞碎裂、崩解，有活性的细胞数逐渐减少。DCN组:药物作用后随时间的延长细胞数无明显减少，无细胞碎裂、崩解，活性细胞形态无明显改变，极少部分细胞贴壁性变差，形成团块状。

4 流式细胞术检测不同浓度DCN对HPF细胞周期的影响

1～10 mg/L DCN使 G0/G1期细胞显著增多(P＜0．05)，5～10 mg/L DCN使S期细胞下降显著(P＜0．05)，没有检测到终末期凋亡细胞。增殖率G2/M%+S%反映了细胞增殖能力，5～10 mg/L DCN使 G2/M%+S%显著下降(P＜0．05)，表明细胞增殖能力下降，见表4。

5 DCN对细胞PCNA表达的影响

细胞阳性表达显示为棕黄色、黄色或浅黄色细小均匀颗粒，分布于整个细胞核;细胞核无着色、胞浆呈淡黄色者为阴性。1～10 mg/L DCN组的阳性细胞数较对照组差异非常显著。PCNA标记指数随着药物浓度增加而递减，说明DCN对HPF PCNA的表达有明显影响并具有浓度依赖性，见表5。

表1 12 h不同浓度DCN及MMC对人翼状胬肉成纤维细胞的抑制作用Table 1．The inhibitory effects of DCN and MMC on human pterygium fibroblasts treated for 12 h(¯x±s．n=15)

表2 24 h不同浓度DCN及MMC对人翼状胬肉成纤维细胞的抑制作用Table 2．The inhibitory effects of DCN and MMCon human pterygium fibroblasts treated for 24 h(¯x±s．n=15)

表3 48 h不同浓度DCN及MMC对人翼状胬肉成纤维细胞的抑制作用Table 3．The inhibitory effects of DCN and MMCon human pterygium fibroblasts treated for 48 h(¯x±s．n=15)

表4 不同浓度DCN作用48 h对细胞周期时相的影响Table 4．Changes of cell cycle of human pterygium fibroblasts treated with DCN at different doses for 48 h(%．¯x±s．n=15)

表5 不同浓度DCN作用48 h对细胞PCNA表达的影响Table 5．Changes of PCNA expression in human pterygium fibroblasts treated with DCN at different doses for 48 h

讨 论

DCN作为TGF－β1的天然抑制剂，具有抗纤维化及抑制细胞生长的两大特性，已被视为对器官纤维化及肿瘤具有良好治疗前景的药物。研究发现，DCN除了可干扰转化生长因子TGF－β与其受体的结合而中和其活性从而具有减轻组织纤维化的作用外，还可修饰胶原蛋白链而调节胶原的合成，与纤连蛋白(FN)和血小板反应蛋白－1(TSP－1)结合从而起到抗黏附、抑制细胞与FN和TSP－1基质结合、调节细胞的增生、转移和浸润的作用。DCN单独或与TSP－1结合能干扰细胞外基质(ECM)分子诱导的内皮细胞受体的激活，从而阻断细胞内转导通路引起的细胞骨架重构、迁移和管样结构的形成［6］。另外，DCN还能与结缔组织生长因子(CTGF)结合［7］，CTGF也是致纤维化因子之一。

DCN抑制包括肿瘤细胞在内的细胞增殖，其机制可能是:(1)DCN能够与TGF－βⅠ、Ⅱ、Ⅲ型受体竞争性结合TGF－β，DCN与TGF－β具有高亲和力，DCN结合TGF－β成为无活性的复合物。一定剂量的DCN能使TGF－β1、TGF－β2和 TGF－β3活性降低，阻断 TGF－β1、TGF－β2和 TGF－β3与相应的TGF－β受体结合。(2)DCN可以与表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)互相作用，使其磷酸化，从而引起丝裂原活化蛋白激酶(mitogen－activated protein kinases，MAPKs)的活化，导致细胞内钙离子动员和细胞周期素依赖性抑制物p21表达，最终导致细胞生长的抑制。p21是周期素依赖性蛋白激酶(CDK)强抑制因子，在不同组织来源的肿瘤细胞研究中也证实DCN抑制细胞生长是通过诱导p21表达［8］。(3)上调细胞内的钙离子浓度，可能激活蛋白激酶C信号通路。DCN可以上调细胞内钙离子浓度，并可被EGFR的特异性阻断剂抑制，提示DCN与EGFR结合后通过上调细胞内钙离子浓度而激活蛋白激酶C信号途径［9］。(4)DCN还可能通过抑制肿瘤血管生成而发挥抗肿瘤作用。Grant等［9］研究证实，野生型肿瘤细胞的分泌物刺激血管内皮细胞的黏附、迁移、分化及出芽过程，而DCN则可抑制这些过程;体内实验则表明，将表达DCN的肿瘤细胞种植于裸鼠体内，肿瘤的生长及血管的生成速度明显减慢，我们还证实DCN的此作用与其抑制肿瘤细胞VEGF的表达及分泌有关。

本实验通过对体外培养的HPF进行观察，发现第2～6代HPF细胞增殖旺盛，传至第7代时，表明细胞开始向其它细胞类型发生转变，为保证细胞活性的一致性，实验均采用第3～4代 HPF，观察10 mg/L DCN、MMC 分别在24 h、48 h、72 h 对翼状胬肉成纤维细胞的影响发现，等浓度的2种药物比较，DCN对细胞形态的改变远远低于MMC。

用流式细胞术分析细胞周期，1～10 mg/L DCN浓度 G0/G1期的细胞比率增高(P＜0．05)，5～10 mg/L DCN使S期的细胞下降(P＜0．05)，表明DCN可以延缓细胞由G1期向S期的过渡，提示DCN可能影响细胞周期，使HPF多数停滞于DNA合成前期，表明DCN可能抑制、干扰DNA合成，使细胞的倍增时间延长。没有检测到终末期凋亡细胞的结果表明DCN对HPF细胞增殖的抑制可能是使得细胞停滞在DNA合成前期，而并不影响细胞凋亡。G2/M%+S%反映了细胞增殖能力，5～10 mg/L DCN使G2/M%+S%显著下降(P＜0．05)，表明细胞增殖能力下降。

PCNA是一种核内蛋白，是DNA复制时 δ聚合酶的辅助物，其出现与细胞增殖有明显关系，直接参与核内DNA的合成，主要表达在细胞增殖周期的S期，被认为是一种准确、简便、并且可直接了解细胞增殖状况的研究指标。通过免疫组化方法对 PCNA表达的检测，揭示 DCN可通过间接抑制 DNA复制而达到其抗增殖作用。经DCN作用后，HPF中PCNA的表达下降，表明 HPF增殖减慢，生长受到抑制，与MTT和流式细胞术结果一致。

目前通过基因克隆技术也已成功获得DCN［10］。从组织中提取天然DCN有广泛的来源和技术上的可行性。鉴于DCN明显抑制纤维化和强的抗肿瘤生长及转移活性，加之其由人体产生、不具免疫原性、取材广泛、可通过基因工程规模化生产等优点，DCN被视为对器官纤维化及肿瘤具有良好治疗前景的药物。尽管如此，但目前尚存许多问题还没有解决，如DCN对不同组织不同细胞，其作用不尽相同，浓度大小作用也不尽相同，国内外有关DCN文献报道其有效工作浓度基本上都是在 mg/L水平，0．01mg/L DCN可刺激正常肝细胞及肝星形细胞的增殖;5～10 mg/LDCN则具有抑制细胞生长的作用。而小剂量的DCN对肝癌细胞系HuH7即有明显的抑制效果［11］。因此只有不断探索，深入研究，才能对其应用前景得出肯定的结论。本文采用的是0．01～10mg/L范围浓度，当DCN药物浓度低时，即＜1mg/L，其抑制作用不明显，当浓度＞1mg/L时，其抑制作用增强增快。

综上所述，本研究从不同角度证实DCN具有很强的抗增殖作用，且在一定药物终浓度范围内呈剂量依赖性，提示 DCN有可能成为新型抗增殖药物，并具有广泛的来源和技术上的可行性。但尚须进一步研究和确认其抗增殖作用的机制。鉴于药物作用在体内外具有一定的差异，我们将进一步观察和研究DCN对动物活体眼的药效及毒性反应，以便确定有效治疗浓度和最佳给药途径，为治疗和预防翼状胬肉的复发寻找新方法。

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