酵母双杂交技术鉴定FAT10新的结合蛋白:eEF1A1*

余 新， 刘天德， 袁荣发， 王庆诺， 李国惠， 邵江华

(南昌大学第二附属医院肝胆外科，江西南昌330006)

泛素(ubiquitin)是在真核生物中普遍存在且具有很高保守性的一种蛋白质［1］。泛素在调节细胞多种生物学过程如细胞周期、细胞凋亡、基因转录等过程中起着重要作用，它的功能异常会导致包括肝癌等恶性肿瘤的发生［2－4］。近年来随着对泛素的进一步研究发现真核细胞中也广泛存在着一些同泛素有着部分相同序列或者功能相近的蛋白，同样发挥着转录后的修饰作用，这一类蛋白被称为类泛素家族，类泛素家族主要分为两类:即类泛素调节子(ubiquitin－like modifiers，UBLs)和泛素结构域蛋白(ubiquitin－domain proteins，UDPs)。UBLs具有同泛素相同的作用特性和功能，研究也证实类泛素化修饰通过调控细胞周期及Wnt信号等在肝癌等恶性肿瘤发生发展过程中同样起着重要作用［5－7］。

FAT10(HLA－F adjacent transcript 10)蛋白属于UBLs蛋白家族，最早是为了鉴别HLA－F基因定位表达而被发现［8］。它是一种由165氨基酸残基组成的18 kD蛋白，由两个泛素样部分前后融合而成。它的N端有29%与泛素相同，而C端有36%相同。同泛素一样，FAT10在C端同样有甘氨酸－甘氨酸残基。另外，在每个组成部分中有保守的赖氨酸残基，类似于泛素的48位赖氨酸残基，被认为是形成多泛素的位点。FAT10属于泛素相关蛋白，参与各种基本的细胞发展，包括信号转导、蛋白易位和细胞周期调控。Hipp等［9］在研究FAT10作用机制中发现FAT10同泛素一样，通过标记底物而被特异性识别，最后被降解，但又不同于泛素的作用通路。

目前泛素/类泛素系统功能异常在恶性肿瘤形成中的作用日益被研究者们所重视，而类泛素的研究才刚刚开始。类泛素蛋白FAT10在近年来的研究中被充分证明在恶性肿瘤的形成或发展中起着重要作用，国外目前对于FAT10作用机制的研究主要局限在其调节有丝分裂阻滞缺陷蛋白2(mitotic arrest－deficient protein 2，MAD2)功能作用方面［10］，对于FAT10在恶性肿瘤形成中的具体作用途径仍然不清。在本研究中，我们选用FAT10蛋白高表达的肝癌细胞株 Hep3B［11］，构建 Hep3B细胞的 cDNA文库，然后利用酵母双杂交技术，以FAT10基因作为“诱饵”，以肝癌细胞株 Hep3B的cDNA文库作为“猎物”，筛选出FAT10作用通路蛋白和同FAT10作用的底物蛋白并分析FAT10对作用蛋白的调控作用。

本文选用 Clontech公司的 Matchmaker GAL4 yeast two－hybrid system 3，诱饵基因构建在 pGBKT7载体中以与GAL4 DNA－binding domain(DNA－BD)融合形式表达，而cDNA文库构建在pGADT7载体中以与GAL4 activating domain(AD)融合形式表达。若诱饵和文库融合蛋白发生相互作用，分别存在这2种蛋白中的DNA－BD和AD相互靠近，从而激活报告基因ADE2、HIS3和MEL1(或lacZ)的转录。因为这些报告基因的转录调控是特殊设计的，由GAL4 upstream activating sequences(UASs)和TATA boxes控制，而诱饵融合蛋白中的DNA－BD可与其中的UASs结合。报告基因的转录成为可通过营养选择和半乳糖苷酶检测检出目的克隆的基础。

材料和方法

1材 料

pcDNA－FAT10质粒和Hep3B细胞cDNA文库由本实验室构建完成，Matchmaker GAL4 yeast two－ hybrid system 3购自 TaKaRa，protein A/G Plusagarose、FAT10和真核翻译延伸因子1α1(eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1，eEF1A1)多克隆抗体均购自 Santa Cruz，转染试剂 Lipofectamine 2000 Reagent购自 Invitrogen，Hep3B细胞和 MHCC97H细胞购自中科院上海细胞库。其它生化试剂和引物合成均购自上海生工公司。

2 方法

2．1 构建诱饵质粒 参照GenBank的FAT10基因(AF123050．1)，采用 Primer 5．0 软件设计特异性引物:上游 5'－CGCGTTACCATGGCTCCCAATGCTTCCTG－3'，下游5'－CCGCTCGAGTCACCCTCCAATACAATAAG －3'，分别在5'端加上 KpnⅠ和 XhoⅠ的酶切位点。采用 Trizol法提取 Hep3B细胞的总RNA，以总RNA为模板，按照PrimeScript® One Step RT－PCR Kit Ver．2试剂盒进行逆转录反应，获得FAT10 cDNA。将目的片段与pMD®18－T Simple Vector载体克隆完成后，用KpnⅠ、XhoⅠ分别双酶切重组pMD18－FAT10质粒及pcDNA5－FRT空载体进行重组，获得pcDNA－FAT10重组质粒。测序鉴定FAT10 cDNA。

pGBKT7－FAT10以pcDNA－FAT10质粒为模板，正义链5'－CGCGAATTCATGGCTCCCAATGCTTCCTGC－3'，反义链 5'－GGCGTCGACTCACCCTCCAATACAATAAGATGC－3'，采用 PCR 方法扩增FAT10基因，下划线区域分别为Eco RⅠ、Bam HⅠ酶切位点。PCR扩增产物经胶回收处理后，Eco RⅠ和SalⅠ双酶切，并克隆至pGBKT7载体中，转化感受态DH5α。pGBKT7－FAT10重组质粒经PCR鉴定、双酶切鉴定后本实验室进行序列测定。

2．2 pGBKT7－FAT10自激活检测 将pGBKT7－FAT10、pGADT7共转化入酵母AH109中，并涂布在SD－Leu－Trp培养基平板上。挑选克隆分别划线在SD－Leu－Trp培养基和SD－Leu－Trp－His培养基平板上(随机挑选4组)。如果该诱饵蛋白没有自激活活性，则只能在SD－Leu－Trp培养基上生长，而不能在SD－Leu－Trp－His培养基上生长，并且β－半乳糖苷酶活性检测呈阴性;而有自激活活性的诱饵蛋白既能在SD－Leu－Trp培养基上生长，也能在SD－Leu－Trp－His培养基上生长，并且β－半乳糖苷酶活性检测呈阳性。

2．3 β－半乳糖苷酶活性检测 将酵母克隆点于滤纸上，液氮中反复冻融3次，每次30s，恢复至室温后将滤纸放于浸有Z buffer(Na2HPO4·7H2O 16.1 g/L，NaH2PO4·H2O 5.5 g/L，KCl 0.75 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L)、β－巯基乙醇和X－α－Gal(20 g/L)的滤纸上，置于30℃培养箱内，直至蓝色出现。8 h之内变蓝为阳性克隆。

2．4 酵母双杂交筛选

2．4．1 酵母双杂交转化方法实验操作按Clontech说明书进行。采用PEG－LiAC将诱饵质粒pGBKT7－FAT10和Hep3B细胞的cDNA文库质粒共转化酵母菌株 AH109。新鲜制备的 AH109感受态细胞8 mL、pGBKT7－FAT10 诱饵质粒 0．2 mg、Hep3B 细胞的cDNA文库质粒0．1 mg、鲑鱼精DNA 20 mg混合后加入1×PEG/LiAc溶液60 mL，经漩涡振荡混匀后30℃孵30 min，加入7．0mL DMSO，充分混匀后水浴42℃热激15 min，放置冰上2 min，1 000×g离心5 min，菌体重新悬浮于10 mL 1×TE(pH 7.0)，并涂布在4块SD－Leu－Trp－His－Ade培养基平板上，30℃倒置培养7 d。

2．4．2 阳性酵母克隆的鉴定与分析应用酵母质粒抽提试剂盒抽提阳性酵母克隆质粒，并将其电转化入E．coli DH5α中，利用氨苄青霉素(Amp)抗性筛选，阳性克隆进行质粒小量抽提试剂盒抽提。PCR扩增 GAL4 AD上的插入片段，上游引物5'－TTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGA －3'，下游引物5'－GATGATGAAGATACCCCACCAAACC－3'。PCR 扩增产物进行HaeШ酶切去重复。然后将含有非重复片段的克隆送公司进行序列测定，测序结果在Gen-Bank上进行同源性搜索和序列比对分析，阳性克隆进行进一步的实验验证。

2．5 酵母双杂交测序阳性克隆回转确证检测 分别将pGADT7－eEF1A1+pGBKT7和pGADT7－eEF1A1+pGBKT7－FAT10共转化AH109，并分别涂布在SD－Leu－Trp培养基平板上，挑选克隆划线在SD－Leu－Trp－His－Ade培养基平板上(随机挑选3组)，并进行β－半乳糖苷酶活性检测。

2．6 荧光共定位 Hep3B细胞培养24～48 h进行爬片，4%多聚甲醛固定，0．5%Triton穿孔，10%正常驴血清封闭非特异性结合位点，分别以羊抗FAT10抗体、兔抗eEF1A1抗体和羊抗FAT10抗体+兔抗eEF1A1抗体孵育过夜，PBS冲洗，以上各组分别用FITC标记的驴抗羊IgG和rhodamine标记的驴抗兔IgG孵育1 h，PBS冲洗后共聚焦显微镜观察并照相。

2．7 免疫共沉淀 去除细胞培养液，用冷PBS洗1次。加RIPA，溶解后，转移到EP管中用振荡混匀，蛋白定量。离心，上清转移到新tube。往上清分别加入FAT10抗体和eEF1A1抗体，4℃旋转混匀过夜，加入protein A/G Plus－agarose，再混匀1 h后使agarose沉淀，去上清。往agarose加RIPA，振荡混匀，离心，去上清。重复4次洗净。加3%SDS缓冲液20 μL，－20℃保存备用。按照加入FAT10抗体的沉淀利用eEF1A1抗体进行Western blotting检测蛋白表达情况，反之，加入eEF1A1抗体的沉淀利用FAT10抗体进行Western blotting检测蛋白表达情况。

2．8 RNA干扰降低FAT10表达后观察eEF1A1的表达情况 RNA干扰降低FAT10的表达的操作按照之前发表的方法进行［12］。提取蛋白后通过Bradford法进行蛋白定量，然后按照RNA干扰组、无意义组、正常组和PBS组上样进行Wester blotting检测。

3 统计学处理

采用SPSS 13．0统计软件，计量资料以均数±标准差(¯x±s)表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 酵母双杂交方法筛选与FAT10相互作用的蛋白

构建的诱饵质粒pGBKT7－FAT10经PCR、双酶切鉴定后递交测序，结果表明插入序列和通读框均正确，见图1。自激活检测确定诱饵无自激活，筛库不需添加3AT，见图2。将pGBKT7－FAT10诱饵质粒和构建在pGADT7载体上的人肝癌Hep3B细胞cDNA文库质粒共转化酵母AH109中，SD－Leu－Trp－His－Ade培养基平板上培养。5～7 d后，从中挑选100个长势良好的克隆进行β－半乳糖苷酶活性检测，得到28个β－半乳糖苷酶活性阳性的克隆，转化效率:28/100×107=2.8×106;同时对阳性克隆进行三报告基因表型鉴定，见图3。

2 FAT10与eEF1A1的回交实验及作用蛋白的确定

Figure 1．The PCR and enzyme digestion identification of the plasmid pGBKT7．A:Lane 2 was PCR －amplified FAT10(498 bp)．B:the recombined plasmids were cut using Eco R Iand Sal I．A 498 bp fragment was apparent in Lane 5 and Lane6，indicating the recombinant plasmid，pGBKT7/FAT10，was constructed successfully．图1 诱饵质粒pGBKT7－FAT10的PCR和酶切鉴定

Figure 2．The fusion protein which expressed by the bait plasmid pGBKT7－FAT10 has no auto－activation．Lane A:positive control，pGADT7－T+pGBKT7－53;Lane B:negative control，pGADT7 － T+pGBKT7 － Lam;Lane C:pGADT7+pGBKT7－FAT10．图2 诱饵质粒pGBKT7－FAT10表达的融合蛋白无自动转录激活作用

为确认FAT10与eEF1A1在酵母中的相互作用，我们进行了回交实验确证检测，见图4:在SDLeu－Trp－His－Ade培养基平板中只有阳性对照和pGADT7－目的基因 +pGBKT7－FAT10能生长，而pGBKT7－FAT10+pGADT7不能生长。之后再进行β－半乳糖苷酶活性检测，见图3:在8 h内只有pGBKT7 FAT10+pGADT7－目的基因和pGBKT7－53+pGADT7－T(positive control)菌落颜色变蓝，为β－半乳糖苷酶阳性。以上结果表明诱饵质粒pGBKT7－FAT10在酵母中能与目的基因编码产物相互作用。抽提阳性克隆中酵母质粒并电转入大肠杆菌 DH5α中，Amp筛选，抽提质粒，PCR扩增pGADT7中的文库插入片段，PCR产物进行酶切后的样品进行琼脂糖凝胶电泳，进行对比除去重复片段，最后将非重复克隆递交测序，测序结果在Gen-Bank上进行同源性和序列比对分析，有一基因eEF1A1(GenBank accession No．NM_001402．5)，编码蛋白eEF1A1。

3 免疫共沉淀和细胞内共定位进一步证实FAT10和eEF1A1存在相互作用

Figure 3．The yeast two－hybrid screen in a Hep3B cDNA library using FAT10 as the bait．A:the transformation rate:from 1 × 107 transformants，28 clones appeared after 5 d;the transformation ratio was 28/100 × 107=2．8 × 106．B:phenotypic identification of three positive clones．a:positive control，pGADT7 － T+pGBKT7 －53;b:negative control，pGADT7 － T+pGBKT7－Lam．图3 以FAT10作为诱饵筛选成人肝癌cDNA文库

Figure 4．Backcrosses revealed three positive clones．A:positive control，pGADT7 － T+pGBKT7 －53;B:negative control，pGADT7－T+pGBKT7－Lam;C:the detection of auto－activation，pGADT7+pGBKT7－FAT10．图4 回交实验验证阳性克隆

免疫共沉淀的结果显示:用抗FAT10抗体获得的免疫复合物中用Western blotting不仅检测到FAT10蛋白还检测到 eEF1A1蛋白，反之用抗eEF1A1抗体获得的免疫复合物中不仅可检测到eEF1A1蛋白还可检测到FAT10蛋白，见图5;而免疫共定位观察显示:经图像并合后证明FAT10蛋白和eEF1A1蛋白在细胞内分布的位置是重合的，这些观察证明FAT10蛋白和eEF1A1蛋白在细胞内可以复合体形式存在，见图6。

4 RNA干扰降低FAT10的表达后观察eEF1A1的表达情况

通过RNA干扰技术我们降低了FAT10的表达，可以观察到FAT10 mRNA表达下调，eEF1A1 mRNA表达随之下调，从而表明FAT10对eEF1A1的mRNA表达存在影响，见图7。

通过RNA干扰技术我们降低了FAT10的表达，随着FAT10蛋白表达下调，可以观察到eEF1A1蛋白表达也下调，见图8，从而表明FAT10对eEF1A1的蛋白表达存在影响。但是这种影响是对mRNA剪切过程的影响还是对mRNA转录过程的影响，还需要进一步研究来证实。

Figure 5．The interaction between FAT10 and eEF1A1 confirmed by co－immunoprecipitation．Lane 1:eEF1A1 and FAT10 were detected in the immunoprecipitant，indicating that FAT10 associates with eEF1A1 when a rabbit anti－ eEF1A1 antibody was used as the bait．Lane 2:FAT10 and eEF1A1 were detected in the immunoprecipitant，meaning that eEF1A1 associates with FAT10 when a goat anti－FAT10 antibody was used as the bait．Therefore，the interaction between FAT10 and eEF1A1 was confirmed．Lane 3:negative control(NC)was only incubated with the second antibody．图5 免疫共沉淀证实FAT10和eEF1A1存在相互作用

Figure 6．Co－localization of FAT10 and eEF1A1 confirmed by immunostaining and confocal laser scanning microscopy．A:endogenous FAT10 was detected with a monoclonal anti－ FAT10 antibody，and conjuncted to Second antibody with FITC，so the green color was detected．B:endogenous eEF1A1 was detected with a monoclonal anti－ eEF1A1 antibody，and conjuncted to second antibody with rhodamine，so the red color was detected．C:colocalized proteins(yellow － orange color)were detected by superimposing pictures of the same focal sections resulting in merging of the red and green colors．图6 免疫荧光染色和激光共聚焦显微镜证实FAT10和eEF1A1共定位

Figure 7．FAT10 siRNA down－regulated eEF1A1 mRNA level．The siRNA fragment for FAT10 was transfected into Hep3B(A)and MHCC97H(B)cells and total RNA was extracted for quantitative PCR．¯x±s．n=6．*P＜0.05 vs other groups．图7 RNA干扰降低FAT10的表达后eEF1A1 mRNA的表达

Figure 8．FAT10 siRNA down－ regulated eEF1A1 protein level．The siRNA fragment for FAT10 was transfected into Hep3B cells(A)and MHCC97H cells(B)．After 48 h，total protein was extracted for Western blotting analysis．图8 RNA干扰降低FAT10的表达后eEF1A1蛋白的表达

讨 论

研究表明FAT10能与人MAD2蛋白非共价结合［9］，研究者们利用这一特点，发现FAT10的过度表达会导致MAD2功能受到抑制，而MAD2蛋白负责在有丝分裂时保持纺锤体的完整性，它的功能受到抑制则引起染色体不稳，这正是许多肿瘤发生的重要特征。Lee等［10］在肝癌、胃癌以及其它类型的肿瘤中发现FAT10蛋白的表达要远高于其癌旁和正常组织，指出FAT10可能在肝癌等恶性肿瘤的形成中起着重要作用。Canaan等［13］通过对FAT10基因缺失小鼠的研究发现，FAT10的缺失会增加肿瘤凋亡的易感性。Zhang等［14］通过对肝癌细胞的体外研究发现，在野生型 p53(wild type p53，wtp53)缺失的Hep3B细胞中FAT10的蛋白表达量要高于含wtp53的HepG2和KB3－1细胞中FAT10蛋白的表达量，当在Hep3B细胞中导入外源性wtp53后会导致FAT10转录表达能力和启动子活性降低;反之，通过RNA干扰减低wtp53的表达量，则会增强FAT10的启动子活性和蛋白表达。最近还发现通过调节FAT10的表达能影响 p53的转录活性［15］。因此，FAT10在肝癌等恶性肿瘤形成中的作用引起了许多研究者的极大兴趣。同时FAT10参与各种基本的细胞发展，包括信号转导、蛋白易位和细胞周期调控。因而研究FAT10的相互作用蛋白对了解FAT10在肿瘤形成或发展中的作用十分重要。

在本研究中，我们通过酵母双杂交筛选出一个1 750 bp的cDNA片段，通过测序获知其同eEF1A1有99．9%相符，因而证实了一个新的FAT10相互作用蛋白——eEF1A1。为了进一步证实 FAT10和eEF1A1存在相互作用，我们利用FAT10和eEF1A1抗体对Hep3B细胞总蛋白进行纯化，然后交叉用eEF1A1和FAT10抗体通过Western blotting检测到eEF1A1和FAT10蛋白的表达，同时利用FAT10和eEF1A1对纯化蛋白检测也能对应检测到蛋白表达。因而我们推测FAT10和eEF1A1相互结合。另外，我们通过激光共聚焦检测FAT10和eEF1A1在细胞内表达情况，观察到两者均在胞浆内表达，并且发现当FAT10和eEF1A1 2种抗体同时孵育的情况下，除了观察到绿色荧光和红色荧光外，还可以观察到大量存在的黄色荧光，这是由于FAT10和eEF1A1存在共定位情况，绿色荧光和红色荧光重叠所致，这也就表明它们之间存在相互作用。综上所述，我们证实FAT10和eEF1A1存在相互作用。

eEF1A1属于G蛋白家族，在哺乳动物细胞中广泛表达，主要参与mRNA翻译。它通过形成eEF1A1－GTP－aa－tRNA复合体将aminoacyl－tRNA(aatRNA)转运到核糖体上的受体位点［16］。在哺乳动物中，eEF1A1除了骨骼肌、心脏和脑外都广泛表达。研究证实eEF1A1在许多肿瘤细胞中都呈现高表达［17－21］。eEF1A1的表达由 p53转录因子正调节，p53正调节eEF1A1使微管切断导致肿瘤细胞的凋亡。Zhong等［22］发现肝癌缺失蛋白1(deleted in liver cancer 1 protein，DLC1)同eEF1A1相互作用，使其能够更容易地定位在actin表达丰富的区域，从而调节细胞的迁移，如导致乳腺癌的转移增加;另外，Zhang等［23］发现 eEF1A1通过调节肝癌细胞株 HepG2和Hep3B中骨桥蛋白半衰期，影响肝癌细胞的迁移。Grassi等［24］观察到eEF1A的2种变体 eEF1A1/2在不同的肝癌细胞中呈现高表达，而且这种高表达是同肝癌细胞的高增殖有关的。eEF1A在细胞内碱性的环境下会诱发肿瘤细胞的生长。这些研究已表明eEF1A1在调控肿瘤细胞各种生物学特性等方面有着重要作用，然而其具体的调控通路需要进一步研究。

在进一步的研究中还观察到在通过RNA干扰降低FAT10的表达后同时伴随着eEF1A1的表达降低，这进一步证实了FAT10和eEF1A1之间存在调控关系。但是这种影响是对mRNA剪切过程的影响还是对mRNA转录过程的影响，还需要进一步研究来证实。Hipp等［9］在研究FAT10作用机制中发现FAT10同泛素一样，通过标记底物而被特异性识别，最后被降解，但又不同于泛素的作用通路。FAT10介导的蛋白酶体的靶向作用不依赖泛素连接系统。FAT10是UBLs家族中第一个像泛素一样，通过26S蛋白酶体途径，与靶向蛋白结合并使之降解的蛋白。然而eEF1A1也被认为是泛素化降解过程中的必要调节途径之一。首先，eEF1A1通过和折叠错误的蛋白结合而并不是纠正这种折叠错误，然后通过蛋白酶体识别后对错误折叠的蛋白进行降解，从而精确控制翻译过程［25］。其次，eEF1A1通过与26S蛋白酶体调控单元Rpt1直接结合对翻译损伤的蛋白识别，并让其同蛋白酶体接近而被降解［26］。Koiwai等［27］的研究表明BPOZ－2(Bood POZ containing gene type 2)与eEF1A1相互结合并能够促使其泛素化及依赖26S蛋白酶体的降解，同时BPOZ－2抑制GTP和eEF1A1的结合从而阻止翻译延伸的过程。

综上所述，FAT10可能通过调节eEF1A1的表达而对肿瘤细胞各种生物学特性发生影响，然而它们之间具体的调控机制还有待进一步研究来证实。所以在后续的实验中，我们将关注它们之间相互作用的分子机制，为进一步研究FAT10在肿瘤的形成和发展中发挥的功能提供更充分的依据。

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