Bmi－1基因过表达对人正常胃黏膜上皮细胞株GES－1增殖的影响*

练国达， 邓 辉， 陈茵婷， 曾林涓， 张秋波， 钱辰琛， 黄开红

(中山大学孙逸仙纪念医院消化内科，广东广州510120)

胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，死亡病例数居癌症导致死亡的第二位［1］。目前认为胃癌的发生、发展是胃正常黏膜上皮细胞通过遗传及表观遗传途径，在幽门螺旋杆菌感染、饮食因素、环境因素等作用下，获得一系列恶性生物学性状的过程。因此，在分子水平深入探索胃癌发生、发展的机制一直是研究的重要方向。

目前的研究已证实，B淋巴瘤莫洛尼鼠白血病病毒插入区1(B lymphoma Moloney murine leukemia virus insertion region 1，Bmi－1)蛋白在人类多种恶性肿瘤中高表达，如头颈部肿瘤［2］、乳腺癌［3］，其表达与肿瘤的发生发展［4］有关。Bmi－1参与细胞周期、干细胞增殖、分化与衰老的调控［5］，也可以诱导细胞的早期转化。本课题组前期研究证实，Bmi－1在胃癌组织中的表达明显升高，是判断胃癌病人预后的独立风险因子之一［6］。Bmi－1与胃癌发展和预后密切相关，但目前尚无关于Bmi－1在胃癌发生发展具体机制的系统研究。本实验通过将Bmi－1基因导入人正常胃黏膜上皮细胞GES－1，建立Bmi－1基因过表达的体外模型，观察转染前后细胞细胞周期、增殖等方面的变化，为进一步研究Bmi－1在胃癌发生发展中所起的作用奠定基础。

材料和方法

1 材料

人胃黏膜上皮细胞株GES－1购买于北京肿瘤研究所，293FT包装细胞购于Invitrogen，2株细胞均应用含10%胎牛血清的高糖型DMEM培养基(Gibco)，在37℃、5%CO2和饱和湿度的培养箱中培养。过表达质粒pBabe－puro－Bmi－1和空质粒pBabe－puro由中山大学肿瘤防治中心曾木圣教授惠赠。鼠抗人Bmi－1单克隆抗体购自Millipore，鼠抗人β－actin单克隆抗体购自Cell Signaling Technology。

2 逆转录病毒包装及转染

采用磷酸钙法转染PIK包装质粒与pBabe－puro－Bmi－1质粒或pBabe－puro质粒于293FT包装细胞产生病毒，提取病毒上清液;取对数期GES－1细胞接种于6孔板，18～24 h后，细胞约70%融合时，将上述病毒上清液加入8 mg/L polybrene(Sigma)，吸干6孔板中的细胞培养基，取含polybrene的病毒上清液加入6孔板中，每孔2 mL。6 h后更换含10%胎牛血清的高糖型DMEM培养基。48 h后用含puromycin(0．5 mg/L)的培养基筛选5 d，通过Western blotting和real－time PCR鉴定稳定细胞株。

3 实时荧光定量PCR检测(real－time PCR)

以Trizol试剂提取细胞总RNA，紫外分光光度仪测定RNA纯度及浓度，逆转录，采用Sybrgreen染料法，采用罗氏荧光PCR仪进行荧光PCR反应。以β－actin为内参照。引物设计如下:Bmi－1上游引物5'－GCTGATGCTGCCAATGGCTCTAA －3'，下游引物5'－TCATTCACCTCCTCCTTAGATTTC－3';β－actin 上游引物5'－TGGCACCCAGCACAATGAA －3'，下游引物 5'－CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA－3'。PCR反应条件:95℃ 2 min预变性，95℃ 30 s，60℃ 35 s，40个循环。

4 Western blotting分析

将细胞接种于6孔板中，待细胞长至90%时，用冷PBS洗2次，用含有蛋白酶抑制剂(PMSF)的RIPA裂解缓冲液裂解细胞，采用BCA法测定总蛋白浓度。取等量总蛋白于10%SDS－PAGE胶电泳。然后将SDS－PAGE凝胶转移至PVDF膜中，恒流(200 mA)转膜70 min。然后取出PVDF膜，置于5%脱脂奶粉中封闭2 h。加入Ⅰ抗(Bmi－1 1∶1 000，βactin 1∶2 000)，4 ℃过夜，TBST 洗膜;Ⅱ抗37 ℃摇床孵育1 h，TBST洗膜。ECL化学发光试剂盒显影，曝光。条带灰度分析采用Glyko BandScan 5．0软件。

5 流式细胞仪检测细胞周期

常规消化处理培养细胞，用70%乙醇4℃固定24 h，加入RNA酶(终浓度为50 mg/L)，37℃反应1 h。加入碘化丙啶(PI，浓度为100 mg/L)溶液染色20～30 min后，在流式细胞仪上进行检测分析。

6 CCK－8法检测细胞生长曲线

取对数生长期的过表达基因组(GES－1－Bim－1)和空质粒组(GES－1－vector)2组细胞接种在96孔板中，每孔细胞1×103，每孔总体积100μL，种板后24 h，每天各组分别取7个孔进行实验并连续测6 d。选6个孔为实验组，避光加入CCK－8 10 μL，另一孔设为对照，不加CCK－8，然后轻摇5 min，放入细胞培养箱，2 h后于酶标仪检测，先以对照孔调零，然后检测实验组波长为450 nm(A450)处的吸光度。细胞增殖倍数=实验组A450值/A0，A0为实验组第1 d的A450值。

7 统计学处理

应用SPSS 13．0统计软件分析。数据用均数±标准差(¯x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，组间两两比较采用最小显著差异法(LSD法)。以P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1 Real－time PCR和Western blotting检测Bmi－1 mRNA和蛋白表达水平

经逆转录病毒介导方法导入质粒后，与空白对照组比较，过表达组细胞Bmi－1 mRNA表达量增加(34．5±2．4)倍，而空质粒组细胞 Bmi－1 mRNA 表达量无明显改变，见图1。Western blotting结果进一步证实，过表达组细胞Bmi－1蛋白表达水平较空白对照组及空质粒组明显升高;Western blotting条带分析表明，与空白对照组比较，过表达组细胞Bmi－1蛋白水平较空质粒组升高约2倍，而空质粒组Bmi－1蛋白水平无明显改变，见图2。

Figure 1．The real－time PCR results for Bmi－1 mRNA expression．¯x±s．n=3．*P＜0．05 vs A or B．A:GES－1;B:GES－1－vector;C:GES－1－Bmi－1．图1 Real－time PCR检测3组细胞Bmi－1 mRNA的表达

Figure 2．Bmi－1 protein expression detected by Western blotting．A:GES－1;B:GES－1－vector;C:GES－1－Bmi－1．¯x±s．n=3．*P＜0．05 vs A or B．图2 Western blotting检测3组细胞Bmi－1蛋白的表达

Real－time PCR和Western blotting结果表明通过逆转录病毒介导，能成功将Bmi－1基因导入GES－1细胞，并能使其在mRNA和蛋白水平持续稳定表达。

2 细胞周期

过表达组细胞G0/G1期占36.18%±1．80%，空质粒组细胞G0/G1期占42．35%±8．25%。过表达组细胞G2/M期占14．89%±2．76%，空质粒组细胞G2/M期占15．70%±6．50%。过表达组细胞S期占48．94%±0．95%，空质粒组细胞 S 期占 41．96%±1.75%。与空质粒组和空白对照组相比，过表达组细胞G0/G1期细胞减少，差异有统计学意义(P＜0.05)，而空质粒和空白对照组之间无显著差异(P＞0.05)，见图3。过表达Bmi－1基因使GES－1细胞S期细胞增多，促进GES－1细胞的增殖。

Figure 3．The cell cycle of GES－1－vector and GES－1－Bmi－1 cells detected by flow cytometry．图3 空质粒组与过表达组细胞周期比较

3 生长曲线

通过CCK－8法连续7 d检测转染Bmi－1质粒、空质粒或未转染的GES－1细胞的吸光值，绘制生长曲线，发现过表达组细胞生长率明显高于空质粒组(P ＜0．05)和未转染的 GES－1(P ＜0．05)。空质粒组细胞和未转染的GES－1细胞之间的生长率差异无统计学意义(P＞0．05)，见图4。

Figure 4．Growth curves of GES－1，GES－1－vector and GES－1－Bmi－1 cells．¯x±s．n=3．*P＜0．05 vs GES－1 or GES－1－vector．图4 CCK－8法检测3组细胞生长曲线

讨 论

胃癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，发病率在人体所有恶性肿瘤中位居第4位，致死率高居第2位，我国和东南亚大部分地区属胃癌高发地区［7］。胃癌的发生发展是一个多因素、多步骤的过程，涉及抑癌基因突变、原癌基因激活、肿瘤转移基因激活等过程。原癌基因Bmi－1属于转录抑制因子Polycomb(PcG)家族［8］，人类Bmi－1基因定位于10号染色体短臂13区，编码一个含326个氨基酸的蛋白质，该蛋白质含有一个环指结构(ring finger domain，RF)和保守DNA结合模序螺旋－转角－螺旋－转角(helixturn－helix－turn motif，H－T－H－T)结构域，这2个区域在调控细胞转化及肿瘤发生发展起重要作用［9］。近年来的研究发现多种恶性肿瘤中均存在Bmi－1基因的异常高表达，同时，Bmi－1蛋白被认为是肿瘤干细胞的标志分子之一［10］。

我们在前期研究中发现在胃癌组织中原癌基因Bmi－1不仅在转录水平，而且在转录后水平均呈高表达，胃癌组织阳性率与肿瘤大小、临床分期、侵润深度、淋巴结转移与否有关;利用Cox比例风险模型分析，发现Bmi－1阳性表达为独立的胃癌预后因素;利用生存分析，发现Bmi－1阴性表达胃癌患者的生存率高于阳性表达胃癌患者，是判断胃癌患者预后的有效指标［11－12］。然而到目前为止，Bmi－1 参与胃癌发生发展的机制尚未阐明。我们通过逆转录病毒介导，将Bmi－1基因导入人正常胃黏膜上皮细胞株GES－1，运用 real－time PCR和 Western blotting方法，证实在mRNA和蛋白水平Bmi－1基因能持续稳定的表达，成功构建了Bmi－1过表达胃黏膜上皮细胞的体外模型，为进一步研究Bmi－1在胃癌中的发生发展机制奠定基础。

研究表明，原癌基因Bmi－1编码的蛋白通过负调控INK4a/ARF位点而影响细胞增殖和凋亡［13］。INK4a/ARF位点编码2种增殖抑制相关蛋白p16INK4a和p19ARF(人类为p14ARF)，这两种蛋白分别通过肿瘤抑制蛋白pRb和转录因子p53相关的细胞周期调节途径发挥作用。pRb在p16INK4a的作用下去磷酸化，从而与转录因子E2F结合而阻止细胞进入S期。p19ARF通过增加锌指蛋白MDM2与转录因子p53的结合，导致细胞出现衰老和凋亡现象。Bmi－1高表达通过抑制p16INK4a和p19ARF的表达，延长细胞增殖期，减少凋亡。本研究发现，过表达Bmi－1使G0/G1期GES－1细胞比例减少，S期及G2/M期细胞比例增加。S期为DNA复制期，G2/M期为DNA合成后期和细胞分裂期，细胞只有跨过G1/S期的阻止点(restriction point，即R点)才能进入下一步DNA复制期，否则进入G0期，停止分裂［14］。本实验结果表明，Bmi－1基因过表达使处于增殖状态的GES－1细胞比例增高。进一步经CCK－8法绘制的细胞生长曲线发现，较空白对照组和空质粒组，过表达Bmi－1使GES－1的增殖速度明显增加;且种板后第6 d、第7 d，空白对照组细胞和空质粒组细胞增殖处于平台期，而过表达组细胞未观察到平台期现象，表明过表达可以使人正常胃黏膜上皮细胞GES－1异常增殖。细胞异常增殖和凋亡是正常细胞癌性转变的基本特征。因此，本研究的结果提示Bmi－1高表达可能导致正常胃黏膜上皮细胞发生恶性转化，启动胃黏膜上皮的癌变。

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