硫唑嘌呤对大鼠骨髓间充质干细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响*

昝 慧， 黄花荣， 钟英强△， 吴新环， 叶小研

(中山大学孙逸仙纪念医院1消化内科，2儿科，广东 广州510120)

骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有多向分化功能［1－2］和免疫调节功能。MSCs治疗炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)具有一定的实验和临床基础［3－5］。需要进行MSCs治疗的IBD患者，主要是反复发作而且是接受硫唑嘌呤(azathioprine，AZA)治疗或依赖者［6］。AZA 对移植的MSCs的增殖与凋亡是否有影响，相关报道极少。我们应用体外实验进行观察不同浓度的AZA对来源于大鼠骨髓MSCs的增殖、细胞周期与凋亡的影响，为临床应用MSCs治疗IBD提供最佳微环境条件。

材料和方法

1 材料与试剂

SD大鼠3周龄，由中山大学动物中心提供(SPF级)，MSCs取自大鼠骨髓。低糖 DMEM(Gibco)，0.25%含EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid)胰蛋白酶(Giboco)，胎牛血清(杭州四季青公司)，大鼠单克隆抗体:anti－CD29(Biolegend)，anti－CD45(Biolegend)，anti－CD34(Santa Cruz)，anti－ CD44(Santa Cruz)。

2 药物与分组

硫唑嘌呤(规格为每片50 mg，上海医药集团有限公司)，硫唑嘌呤的浓度设计为0、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L和300 mg/L，相应分为5组:对照组A 与研究组 B、C、D、E 组。

3 方法

3．1 SD大鼠骨髓MSCs的分离与培养 原代培养采取全骨髓法:SD大鼠颈椎脱臼处死后于75%乙醇中浸泡5 min，移入超净台，取出双下肢股骨及胫骨，眼科剪剪去股骨及股骨骨骺，用无血清的DMEM培养基反复冲洗骨髓腔，收集骨髓，将获得的骨髓细胞悬浮液移入离心管，以1 000 r/min的速度离心10 min，弃上清，用低糖DMEM含10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)重悬，接种于25 cm2培养瓶中，放置于5%CO2培养箱内培养。2 d后换液1次，去除未贴壁细胞，倒置相差显微镜观察细胞生长情况及形态特征，以后每3 d换液1次，当细胞铺满瓶底80%～90%时，用0．25%含EDTA胰蛋白酶消化，按照1∶2传代培养。

3．2 MSCs免疫表型的鉴定 检测第4代MSCs表面标志CD29、CD34、CD44和CD45的表达及表达细胞比例。MSCs放置于5%CO2培养箱内培养至第4代，细胞经胰酶消化后，PBS洗涤2次，调整细胞密度至1×109/L，每管加入100μL相关抗体，室温避光孵育20 min，行流式细胞仪检测。

3．3 绝对计数法绘制MSCs生长曲线 取第3代细胞，细胞计数后以5×107/L接种至6孔板培养，每孔1 mL，MSCs放置于5%CO2培养箱内培养。每天消化并计数3个复孔，连续测7 d。重复3次实验，在显微镜的低倍镜下进行细胞直接计数，绘制出MSCs生长曲线。

3．4 硫唑嘌呤对SD大鼠MSCs凋亡和细胞周期的影响 取第3代细胞，计数后以2×108/L接种至6孔板培养，每孔2 mL，MSCs放置于5%CO2培养箱内培养。大约第4 d细胞融合达70%～80%时换用含有10%胎牛血清的DMEM培养随机分为5组，每组3个复孔，作用24 h、48 h与72 h。细胞消化后，收集细胞，以PBS重悬为(1～5)×109/L的细胞悬液1．0 mL，0．5 mL 立即用于凋亡检测，0．5 mL 用于细胞周期检测。

4 统计学处理

数据用均数±标准差(¯x±s)表示，多组间均数比较采用方差分析，两组均数比较采用t检验，SPSS 13．0软件包处理，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 SD大鼠骨髓MSCs培养后形态特点

原代培养2 d后换液，显微镜下密布着大小不等的细胞集落，细胞形态较均一，呈放射状排列，伸出长短不一、粗细不均的突起，核浆比例大。原代细胞大约10～12 d后消化传代，传代培养的细胞可在48 h之内贴壁，呈长梭形、不规则形，生长旺盛，形成典型的“漩涡状”形态，伴有突起，较原代细胞扁平，核较大，呈椭圆形，核仁明显，核浆比例大，6 d可铺满瓶底80%，前期细胞传代过程中混杂大量其它类型细胞，通过3次传代可逐渐纯化MSCs，见图1、2。

2 SD大鼠骨髓MSCs免疫表型

第4代MSCs表面标志CD29的阳性率为98.25% ±0.58%，CD34的阳性率为1.11% ±0.34%，CD44的阳性率为98.97% ±0.53%，CD45的阳性率为0.99% ±0.53%，表明本次获得细胞为MSCs，见图3。

Figure 1．Morphological feature of MSCs under phase－contrast microscope(×100)．A:3 d;B:5 d;C:7 d．图1 在相差显微镜下大鼠骨髓MSCs的形态特点

Figure 2．Morphological feature of MSCs after methyl violet staining(×40)．A:3 d;B:5 d;C:7 d(swirling growth)．图2 大鼠骨髓MSCs甲基紫染色后的形态特点

Figure 3．Expression of CD29，CD34，CD44 and CD45 in rat MSCs detected by flow cytometry．图3 流式细胞仪检测大鼠MSCs第4代细胞表面CD抗原的表达

3 AZA对大鼠MSCs生长曲线的影响

大鼠MSCs在培养的第2～5 d处于快速的对数生长期，第6 d进入生长平台期，见图4A。应用AZA作用于大鼠MSCs后，第1 d与2 d无明显影响，第3 d，与空白对照组比较，50 mg/L与100 mg/L AZA作用下，MSCs增殖虽然受到抑制，但无显著差异(P＞0.05)，而在200 mg/L与300 mg/L浓度下 MSCs生长受到明显抑制(P＜0.05)，前者大鼠MSCs的增殖抑制率为64.86% ±0.38%，后者抑制率为67.78% ±0.37%，见图4B。

4 AZA对大鼠MSCs集落与形态的影响

200 mg/L和300 mg/L AZA作用于大鼠MSCs 72 h，细胞集落数量明显减少，集落变小，细胞形态变窄小，见图5。

5 AZA对大鼠骨髓MSCs凋亡的影响

各浓度组AZA作用24 h对MSCs的凋亡率均无影响。与空白对照组相比，200 mg/L AZA作用48 h和72 h，大鼠MSCs凋亡率明显升高(P＜0.05);300 mg/L AZA作用48 h，MSCs的凋亡率明显升高(P＜0.05)，而作用72 h，MSCs的凋亡率与空白对照组相比明显降低(P＜0.05)，而MSCs坏死率明显升高(P＜0.05)，见图 6、表1。

Figure 4．Effect of AZA on the proliferation of rat MSCs．A:normal growth curves of the fourth generation of rat MSCs;B:growth curves of the fourth generation of rat MSCs treated with different concentrations of AZA．¯x±s．n=3．图4 AZA对大鼠骨髓MSCs增殖的影响(绝对计数法)

Figure 5．Effect of AZA on the colony formation and morphosis of MSCs(methyl violet staining，×40)．A:50 mg/L AZA for 72 h;B:100 mg/L AZA for 72 h;C:300 mg/L AZA for 72 h．图5 AZA对大鼠MSCs集落与形态的影响

Figure 6．Effects of AZA on the apoptosis and necrosis of MSCs(for 72 h)．A:control;B:50 mg/L AZA;C:100 mg/L AZA;D:200 mg/L AZA;E:300 mg/L AZA．图6 AZA对MSCs凋亡率和坏死率的影响

6 AZA对大鼠骨髓MSCs细胞周期的影响

在24 h各浓度组AZA对MSCs的细胞周期均无影响。在48 h，300 mg/L AZA使 MSCs进入 G0/G1期细胞增多，S期细胞减少(P＜0.05)。在72 h，200 mg/L和300 mg/L浓度AZA使MSCs处于G0/G1期增多，而S期细胞明显减少(P＜0.05);300 mg/L浓度下MSCs处于G2－M期的细胞也明显减少(P＜0.05)，见图7、表 1。

Figure 7．Effect of AZA on the cell cycle of MSCs(for 72 h)．A:control;B:50 mg/L AZA;C:100 mg/L AZA;D:200 mg/L AZA;E:300 mg/L AZA．图7 AZA对MSCs细胞周期的影响

表1 AZA对MSCs凋亡、坏死和细胞周期的影响Table 1．Effects of AZA on the apoptosis，necrosis and cell cycle of MSCs(%．x¯±s．n=3)

讨 论

骨髓MSCs对IBD受损的肠道黏膜有修复作用［7］，而肠道微环境亦对MSCs的增殖与分化有一定影响［8］，这些微环境因素包括MSCs与周围肠黏膜细胞的相互作用、黏膜所产生的细胞因子与MSCs的作用、药物对MSCs的影响等。MSCs经静脉输注入体内后，能定植到受损组织的数量就很少［9－11］，因此，凡能影响其增殖与分化功能的因素，均可明显影响MSCs移植治疗IBD的效果。

AZA可特异性地抑制核糖核酸合成，抑制T细胞的免疫反应，具有一定抗免疫作用，其抗免疫作用由细胞内的活性代谢产物6－巯基嘌呤所介导［12］。AZA对MSCs增殖与分化影响的研究很少，Lazebnik等［6］对应用5－氨基水杨酸、强的松、AZA和甲氨蝶呤治疗的44例溃疡性结肠炎患者进行了MSCs移植治疗，观察了2年，32例治疗有效，占72．7%;12例(27．3%)治疗无效，但文中并未指明无效者是否与应用AZA治疗有关。王莉等［13］观察了部分细胞毒药物(马利兰、阿霉素、环磷酰胺、足叶乙甙、甲氨蝶呤、长春新碱和顺铂)对小鼠肺组织和骨组织间充质干细胞增殖和分化的影响，其中对嘌呤代谢有影响的2种细胞毒性药物阿霉素和长春新碱对MSCs的增殖有明显抑制作用，对其分化功能也有一定影响。这提示AZA也可能对骨髓MSCs的增殖有影响。

本研究发现，小于100 mg/L浓度的 AZA对MSCs的增殖、细胞周期与凋亡无显著影响，而AZA在大于200 mg/L浓度下作用72 h后，MSCs生长受到明显抑制，抑制率大于66%，凋亡率明显升高，300 mg/L作用于72 h，MSCs的凋亡率则明显降低，坏死率明显升高。这提示一定浓度的AZA，随着作用时间延长，会促进MSCs凋亡，但大剂量时就会直接造成MSCs死亡。同时，大于200 mg/L浓度的AZA，随着作用时间延长，使MSCs进入G0/G1期细胞增多，S期细胞减少，因而引起MSCs的有丝分裂减少。这提示AZA会引起定植的MSCs过多处于G0/G1期，影响其增殖与分化。

因此，在应用MSCs移植治疗IBD时，应减少AZA的用量或最好不用，否则可能会影响MSCs在受损肠道的增殖，进一步可引起细胞凋亡或死亡，直接影响移植治疗的效果。

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