水通道蛋白4和8在人不同病理级别星形细胞瘤组织中的表达*

朱淑娟， 孙善全△， 许士叶， 张兴业， 甘胜伟

(1重庆医科大学神经科学研究中心，重庆400016;2西安市第一人民医院神经外科，陕西西安710038)

水分子和离子平衡的调节对维持正常脑功能是非常关键的。在中枢神经系统中，星形胶质细胞作为哺乳动物脑内最丰富的细胞类型，其调控作用主要依赖于水通道蛋白(aquaporins，AQPs)、离子通道蛋白及其锚定蛋白三者之间的相互作用而实现的［1］。大量的研究显示:这些通道蛋白在细胞的表达和极化分布方式被打乱之后，将引起离子和细胞容积的平衡被破坏。另外，血脑屏障中水通道的表达变化也是胶质瘤性脑水肿发生的重要分子机制［2］，但对其增殖、生长机制仍无定论。本实验从星形胶质瘤的恶性程度角度，探讨了 AQPs成员中AQP4和AQP8在人不同病理级别星形细胞瘤组织中的表达变化，为初步阐明AQPs在星形细胞瘤增殖生长中的机制提供实验依据。

材料和方法

1 病例及标本采集

星形细胞瘤标本均取自重庆医科大学附属第一医院神经外科和第三军医大学大坪医院神经外科星形细胞瘤的患者，共55例;以患者肿瘤周围相对正常脑组织作为对照组。所有标本自术中取出后，一部分用于病理检查，另一部分则置于液氮中迅速冷冻后，－80℃保存。经病史询问，所有患者术前均未接受过免疫治疗、放疗、化疗等治疗手段。

2 主要试剂及仪器

单克隆小鼠抗人AQP4和AQP8抗体均购自Abcam;辣根酶标记的兔抗山羊IgG、山羊抗小鼠IgG、DAB显色试剂盒和Ⅱ抗试剂盒购自中杉金桥公司;β－actin抗体购自武汉博士德公司;SDS聚丙烯酰胺凝胶配置试剂盒、Trizol和AMV逆转录试剂盒购自TaKaRa。

3 HE及免疫组织化学染色

将所取相对正常脑组织与各级星形胶质瘤组织常规固定后，行石蜡包埋，连续切片，厚度为5μm。脱蜡后HE染色，进行诊断和病理分级。选片，常规脱蜡，枸橼酸盐溶液(pH 6．0)修复(95℃，40 min)后，按照二步法试剂盒说明书操作，AQP4Ⅰ抗浓度为1∶500(PBS 配制)，AQP8Ⅰ抗浓度为 1∶350(PBS配制)，DAB显色试剂盒显色，苏木精复染细胞核，脱水透明后封片，显微镜观察。采用北航生物医学图像分析系统(CM－2000B)进行图像分析，测定免疫组化阳性反应细胞的积分吸光度值(IA)。

4 Western blotting检测

用细胞裂解液(碧云天)提取对照组和各级星形胶质瘤组织样品总蛋白，10%SDS－PAGE凝胶分离蛋白，通过湿转方式将蛋白转至0．45μm孔径的硝酸纤维膜上，用Ⅰ抗封闭液室温封闭2 h后，分别加入含 AQP4(1∶1 500)、AQP8(1∶1 000)和 β － actin(1∶5 000)的Ⅰ抗稀释液(PBS配制)，4℃过夜孵育，PBST洗膜3次，10 min/次，分别滴加山羊抗小鼠IgGⅡ抗(1∶5 000)(PBS配制)稀释液，37℃孵育2 h，PBST洗膜3次，10 min/次，DAB 试剂盒显色，用Quantity One软件转换后BandScan软件测定条带灰度值。将AQP4和AQP8分别与β－actin灰度值的比值作为观察指标，进行统计学分析。

5 逆转录聚合酶链式反应(RT－PCR)

对照组及不同病理级别星形胶质瘤组织各100 mg。按Trizol提取程序(说明书)提取组织总RNA;按AMV逆转录试剂盒操作说明进行逆转录后，4℃保存。扩增引物:AQP4上游引物5'－ggaatttctggccatgctta－3'，下游引物 5'－ aagacagacttggcgatgct－3'，扩增片段产物长231 bp。AQP8上游引物5'－tcctgaggagaggttctgga－3'，下游引物 5'－ agagggccctttgtcttctc－3'，扩增产物长159 bp。β－actin上游引物5'－ ctgccgcatcctcttcctc－3'，下游引物 5'－ ctcctgcttgctgatccacat－3'，扩增产物长 398 bp。扩增条件:94℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 20 s，共35个循环。2%琼脂糖凝胶电泳后，凝胶成像仪观察并照相，用Band Scan 5．0软件测定条带灰度值，将 AQP4 mRNA、AQP8 mRNA分别与β－actin mRNA灰度值的比值作为观察指标，做统计学分析。

6 统计学处理

数据均用均数±标准差(¯x±s)表示，采用SPSS 13．0软件对数据进行统计学分析，完全随机设计，运用两组间比较的秩和检验，以P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1 病理诊断结果

按照世界卫生组织(WHO)对脑细胞瘤分级的诊断标准，结果显示:星形细胞瘤Ⅰ级5例，星形细胞瘤Ⅱ级17例，间变性星形细胞瘤(Ⅲ级)19例，胶质母细胞瘤(Ⅳ级)14例，见图1。

Figure 1．Different pathological grades of the astrocytoma samples(HE staining，×400)．A:astrocytoma(WHO gradeⅠ);B:astrocytoma(WHO gradeⅡ);C:anaplastic astrocytoma(WHO gradeⅢ);D:glioblastoma(WHO gradeⅣ)．图1 星形细胞瘤标本的病理分级

2 AQP4和AQP8的免疫组织化学结果

对照组中AQP8主要表达在神经元和少量星形细胞细胞内，各病理级别星形细胞瘤组织中AQP4和AQP8主要表达在瘤性星形细胞的胞膜和胞质内。图像分析结果显示，和对照组比较，低级别(Ⅰ～Ⅱ级)肿瘤组织中AQP4表达减少(P＜0．05)，高级别(Ⅲ～Ⅳ级)肿瘤组织中AQP4表达增多(P＜0．05);而低级别肿瘤组织中AQP8的表达明显增多(P＜0.05)，高级别肿瘤组织中AQP8的表达进一步增强(P＜0.05);低级别(WHOⅠ～Ⅱ级)肿瘤组织之间、高级别(WHOⅢ～Ⅳ级)肿瘤组织之间比较，AQP4和AQP8表达均无明显差异(P＞0．05)，见图2、3和表1。

Figure 2．The immunohistochemical staining of AQP4( ×400)．A:astrocytoma(WHO gradeⅠ);B:astrocytoma(WHO gradeⅡ);C:anaplastic astrocytoma(WHO gradeⅢ);D:glioblastoma(WHO gradeⅣ);E:control group．图2 免疫组化染色显示AQP4的分布

Figure 3．The immunohistochemical staining of AQP8( ×400)．A:astrocytoma(WHO gradeⅠ);B:astrocytoma(WHO gradeⅡ);C:anaplastic astrocytoma(WHO gradeⅢ);D:glioblastoma(WHO gradeⅣ);E:control group．图3 免疫组化染色显示AQP8的分布

表1 对照组和各不同病理级别星形细胞瘤组织中AQP4和AQP8的免疫组化染色Table 1．The IA of AQP4 and AQP8 positive cells in control group and astrocytoma tissues of various pathological grades(IA．¯x±s．n=9)

3 AQP4和AQP8及其mRNA的含量变化

Western blotting与RT－PCR结果一致显示，在对照组及各肿瘤组织中均可看到AQP4和AQP8及其mRNA特定的免疫阳性反应产物。条带分析及统计学结果显示，随肿瘤病理级别的升高，AQP4及其mRNA在低级别肿瘤组织(WHOⅠ～Ⅱ级)中表达减少(P＜0．05)，而在高级别肿瘤组织(WHOⅢ～Ⅳ级)中表达增强，和对照组及低级别肿瘤组织(WHOⅠ～Ⅱ级)比较，P＜0．05。AQP8及其 mRNA在低级别肿瘤组织表达增强(P＜0．05)，在高级别肿瘤组织中表达进一步增强，和对照组及低级别肿瘤组织(WHOⅠ～Ⅱ级)比较，P＜0．05。AQP4和 AQP8在低级别肿瘤组织之间、高级别肿瘤组织之间分别比较，P ＞0．05，见图4、5。

讨 论

1 AQP4在星形细胞瘤中的作用

AQP4是哺乳动物脑内主要的水通道蛋白，首次在大鼠肺脏被克隆［3］;AQP4广泛分布于脊髓、视网膜、内耳及骨骼肌等兴奋性组织［4－6］中的神经支持细胞，如:中枢神经系统的星形胶质细胞和室管膜细胞，视网膜 Müller胶质，内耳 Hensen's、Claudius和内沟细胞等。在脑内，AQP4多集中在毛细血管周围的胶质细胞终足膜、胶质界膜、室管膜细胞及室管膜下的星形细胞，主要控制脑内水的流动，促使星形胶质细胞迁移，改变神经元活性。AQP4在星形胶质细胞膜的极化分布与血管内皮细胞向星形细胞传递信号有关。AQP4不仅是一种通道蛋白，而且还是一种渗透压感受器，它除了调节脑组织的水代谢之外还可能在脑脊液形成和细胞容积变化方面具有重要作用［7］;另外［8］，AQP4 和 Kir4．1 在功能方面相互作用，参与星形胶质细胞膜上水的转运和钾离子的虹吸。

Figure 4．Expression of AQP4(A)and AQP8(B)proteins in human astrocytoma tissues of various pathological grades and control group．1:control group;2:astrocytoma(WHO gradeⅠ);3:astrocytoma(WHO gradeⅡ);4:anaplastic astrocytoma(WHO grade Ⅲ);5:glioblastoma(WHO gradeⅣ)．¯x±s．n=9．*P＜0．05 vs control;#P＜0．05 vs gradeⅠorⅡ．图4 星形细胞瘤组织中AQP4和AQP8蛋白的表达

Figure 5．Expression of AQP4(A)and AQP8(B)mRNA．M:marker;1:control group;2:astrocytoma(WHO gradeⅠ);3:astrocytoma(WHO gradeⅡ);4:anaplastic astrocytoma(WHO gradeⅢ);5:glioblastoma(WHO gradeⅣ)．¯x±s．n=9．*P＜0．05 vs control;#P ＜0．05 vs gradeⅠorⅡ．图5 星形细胞瘤组织中AQP4和AQP8 mRNA的表达

Saadoun等［9］应用免疫组化在5例患者脑肿瘤组织(没有进行病理分级)中发现AQP4表达减弱，Warth等［10］又在高级别星形细胞瘤中发现AQP4高表达;关于AQP4在不同病理级别的星形细胞瘤组织中的表达情况尚未见报道。本实验结果显示AQP4在低级别星形胶质瘤组织中表达减少，而在高级别肿瘤组织中表达增强，与Saadoun和Warth的结果相符合。AQP4在低级别肿瘤组织中呈现胞内及胞膜弱表达，提示低级别星形细胞瘤细胞可能出现:(1)AQP4生成减少;(2)AQP4锚定机制损伤，重新分布。AQP4在高级别星形细胞瘤组织中的表达升高可能与肿瘤细胞在快速增殖生长过程中的水转运有关，然而这些推测尚须进一步通过实验加以验证。

2 AQP8在星形细胞瘤中的作用

AQP8作为水通道蛋白家族成员之一，主要分布在消化道上皮细胞(特别是结肠)、肝及胰腺以及男性和女性生殖系统，但其功能至今仍不甚清楚。人AQP8 cDNA编码261个氨基酸，其74．1%和大鼠AQP8同源，76%和小鼠同源。AQP8基因含有5个内含子，外显子－内含子分界点和其它哺乳动物不同，这可能和种系发生有关。人AQP8位于染色体16p12 位点［11］。实验显示［12］，在分离纯化的大鼠AQP8、人AQP8和小鼠AQP8蛋白中，人AQP8转运水分子和氨，不转运甘油和尿素，其可能在酸碱平衡中发挥重要作用。Su等［13］利用AQP8基因敲除小鼠，发现AQP8缺失可以通过减少卵泡细胞的凋亡而增加成熟卵泡细胞的数量。在原发性羊水过多时［14］，羊膜上的AQP8表达增加，而在胎盘却表达下降，提示AQP8在调节羊水体积方面起了重要作用。

肝细胞主要表达AQP8，AQP8起初位于胞内囊泡，在双丁酰 cAMP的诱导下，重新定位至浆膜上［15］。胰高血糖素可诱导剂量依赖性的浆膜AQP8表达上调，同时胞内膜AQP8的下降，表明AQP8从胞内囊泡到浆膜的再分布。有文献报道，正常肝细胞通过AQP依赖的水转运快速对渗透压变化作出反应，从而遭遇凋亡后的细胞死亡结局;在原代培养的鸡肝细胞膜上，30 mmol/L的高糖即可增加AQP8的转位(从胞内膜移动到胞浆膜)，并呈浓度依赖性，30 mmol/L甘露醇没有影响 AQP8 转位［16］;Magdeldin等［17］研究表明，actin相关蛋白家族可能参与调节AQP8分泌小泡迁移并整合到细胞膜的过程。与正常肝细胞相比，肝细胞癌AQP8和AQP9表达明显下调［18］，AQP8和AQP9过表达可促进肝细胞的凋亡。上述结果提示，AQP8转位至胞膜时，可发挥其水分子快速转运的能力。Calamita等［21］的实验研究表明:AQP8介导的水转运在线粒体快速肿胀过程中起着非常重要的作用。

尽管水分子进出线粒体的运动对维持其形态和功能十分重要，然而水分子通过线粒体内膜的分子机制仍然不清楚。资料显示［19］，线粒体决定细胞的生死状态。在生理条件下，AQP8和AQP9表达在不同组织细胞的线粒体内膜上(包括肝、肾和脑)，调节水分子和代谢底物的转运，参与凋亡刺激引起的渗透膨胀。实验发现［20］，AQP8介导的线粒体对甲酰胺的转运能力高于对水的转运，表明线粒体内膜上AQP8的主要作用是转运氨。凋亡作为保守的细胞过程，最早的形态学特征之一是显著的细胞皱缩(AVD)。于 AVD期间，在 Na+/K+ATP酶抑制之后，Na+、K+被挤出细胞，胞外Na+堆积，细胞内外离子浓度发生变化，从而形成一个渗透梯度，激活AQPs其它成员(如:AQP4的表达)，介导细胞内水分子外流，最终导致细胞皱缩。

Fischer等［22］发现，AQP8 分布在正常结肠上皮细胞的腔面，而在结肠癌组织中，AQP8没有或极少表达。由此可见，AQP8在细胞内、外水电解质分布失衡的过程中，具有重要作用，其过表达可促进细胞凋亡，而在肿瘤细胞，AQP8表达下调，则可维持肿瘤细胞的增殖与生长。然而，本实验结果表明，在星形细胞瘤组织中，AQP8大量分布在瘤细胞的胞膜和胞浆内，这可能与AQP8的合成增多有关;AQP8的表达和肿瘤病理级别相关:与对照组相比较，AQP8在低级别肿瘤组织中表达上调，在高级别肿瘤组织中表达进一步增强。推测肿瘤细胞在增殖的过程中，体积增大，含水量增加;水通道蛋白在快速转运水分子的同时，肿瘤细胞可获取大量营养物质和必需的生长因子以备增殖［23］。

由此看来，在不同部位，AQP8的分布具有差异性;在不同病理生理条件下，AQP8的表达同样具有差异性;在细胞的生长去向过程中，AQP8究竟促使其走向凋亡还是永生化，其作用机制值得进一步研究。

(致谢:感谢重庆医科大学第一附属医院神经外科孙晓川教授、何朝辉博士和第三军医大学大坪医院神经外科沈光建教授在标本采集方面给予的帮助。)

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