siRNA抑制PPARγ表达对绒癌细胞JEG－3侵袭力的影响

许 华， 陈丽君

滋养细胞浸润是人类胎盘及胚胎发育的关键过程，其结果为胚胎植入母体组织，间质成分以及母胎间血管浸润。母体螺旋动脉周围血管平滑肌的退化以及内皮细胞被滋养细胞取代，最终可导致血管腔的扩张，增加绒毛间血流供应［1－2］。妊娠期母儿间特殊的血管联系，使胎儿从母体中得到了持续的养分及血氧供应。滋养细胞侵袭能力不足与各种不同的病理妊娠有关。底蜕膜的浅浸润以及螺旋动脉重铸受阻，可导致子痫前期、胎儿生长受限及自然流产等病理妊娠的发生［3－5］。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator－activated receptor gamma，PPARγ)属配体依赖的核激素受体超家族成员，广泛存在于各种组织中，PPARγ处于多种信号转录途径的交叉点，被配体激活后在转录水平上抑制多种细胞的增殖、侵袭、分化和凋亡，在滋养细胞中广泛存在［6］，由于JEG－3细胞株的生物学特性与细胞滋养层细胞(cytotrophoblasts)的特性非常相似，本实验将PPARγsiRNA转染JEG－3细胞，观察其对JEG－3细胞侵袭能力的影响，从而探讨子痫前期、胎儿生长受限及习惯性流产等病理妊娠的发病机制。

材料和方法

1 主要试剂

人绒毛膜上皮癌细胞JEG－3购自中科院上海生命科学院。RPMI－1640培养液(HyClone)，胎牛血清(上海复蒙)，siRNA(广州锐博生物)，逆转录试剂盒(TaKaRa)，SYBR Premix TaqTM(GeneCopoeia)，Trizol(TaKaRa)，Transwell小室(膜孔径 8μm)(Costar)，Matrigel基质胶(BD)，转染试剂 Lipofectamine 2000(Invitrogen)，其它试剂均为国产分析纯。

2 主要方法

2．1 细胞培养 JEG－3细胞采用含有10%胎牛血清的RPMI－1640培养基培养，置于温度37℃、湿度95%、5%CO2的培养箱中培养。细胞经0．25%含EDTA胰酶消化后，以5×105cells/well的密度接种于6孔板中，用于转染及测定转染效率，提取细胞中mRNA以及观察细胞的侵袭能力。

2．2 siRNA的合成与转染 根据 GenBank中PPARγ的序列号，由广州锐博生物技术公司设计合成siRNA，产品为3条对 PPARγ高效沉默的双链siRNA，序列分别为:S1正义链5'－AGAUAAAGCUUCUGGAUUUdTdT －3'，反义链 3'－ dTdTUCUAUUUCGAAGACCUAAA－5'，其针对靶序列为 AGATAAAGCTTCTGGATTT;S2正义链5'－AGGAAAGACAACAGACAAAdTdT－3'，反义链 3'－dTdTUCCUUUCUGUUGUCUGUUU－5'，其针对靶序列为 AGGAAAGCAAA;S3正义链5'－GUACCAAAGUGCAAUCAAAdTdT －3'，反义链 3'－ dTdTCAUGGUUUCACGUUAGUUU－5'，的针对靶序列为 GTACCAAAGTGCAATCAAA。非特异性阴性对照(negative control)siRNA的序列不靶向沉默人类目前已知的任何基因，并且与PPARγ基因不具有同源性。带有荧光标记的siRNA用于检测转染效率，本实验中的阴性对照siRNA带有荧光标记Cy3，最大发射波长为570 nm，荧光显微镜下观察绿色光下发红光。siRNA产品按说明书用灭菌ddH2O配制成20μmol/L溶液，分装保存于－20℃中。常规培养JEG－3细胞后，将细胞按5×105cells/well密度接种至6孔板中，培养箱中孵育约24 h后，细胞生长融合度约为30% ～50%时，进行转染。具体步骤按提供的说明书进行。

2．3 电子荧光显微镜观察转染效率 根据推荐浓度，分别以100、50 nmol/L的终浓度将带有荧光标记的阴性对照siRNA(浓度过低转染效率可能会低，浓度过高可能产生脱靶效应及增加细胞毒性)，2μL Lipofectamine 2000转染6孔板中的JEG－3细胞，转染后6 h置于电子荧光显微镜下观察转染效率，实验重复3次。经过观察，以终浓度为100 nmol/L时进行转染效率最高，备下面继续研究。

2．4 实时定量PCR技术检测PPARγ及黏蛋白－1(mucin－1，MUC1)mRNA的表达 广州锐博生物技术公司提供的PPARγ特异性siRNA共有3条链:S1、S2及S3，为测定这3条链对PPARγ基因的抑制率，设实验(1)为S1组(转染PPARγ特异性siRNA中的S1链)、S2组(转染PPARγ特异性siRNA中的S2链)、S3组(转染 PPARγ特异性 siRNA中的 S3链)、S4组(转染混匀的PPARγ特异性siRNA中的S1、S2、S3链)和阴性对照组(转染阴性对照 siRNA)。每组设3个复孔，转染24 h后提取各组JEG－3细胞的总RNA，按RT试剂盒说明书反转录为cDNA后，应用实时定量PCR技术检测PPARγmRNA，引物由广州复能基因有限公司设计合成，PPARγ的引物序列为上游5'－GAACAGATCCAGTAATTGCAG －3'，下游5'－AGGCTCTTCATGAGGCTTATTG －3'，扩增长度为137 bp;管家基因β－actin引物序列为:上游5'－ CCAACCGCGAGAAGATGA －3'，下游 5'－CCAGAGGCGTACAGGGATAG －3'，扩增片段长度为97 bp。反应体系总体积25μL，在LightCycler 2．0 real－time PCR扩增仪上扩增，退火温度50℃ 20 s，40个循环。采用2－ΔΔCt相对定量法计算各组PPARγ表达量与β－actin表达量的比值，置空白对照组的值为1，换算出各组PPARγmRNA的表达水平。实验重复3次，取其平均值。实验证明，S2链siRNA对PPARγ的抑制效率最高，用于实验组，以备后续实验。

另设实验(2)为实验组(转染PPARγsiRNA)、阴性对照组(转染阴性对照siRNA)和空白对照组(不转染任何siRNA，余试剂与其它2组相同)，每组设3复孔，检测PPARγ及MUC1 mRNA的表达。MUC1引物序列:上游5'－GGAAGACCCAGCACT－3'，下游5'－CACAGATCC TGGCCTGAAC －3'，按上述步骤进行，实验重复3次，取其平均值。

2．5 Matrigel侵袭实验检测转染后细胞的侵袭能力

取30μL按1∶5稀释的Matrigel基质胶包被Transwell小室(8μm孔径)的上面，37℃培养箱中放置4 h。将转染后24 h的各组细胞收集后，分别用含10%胎牛血清的RPMI－1640培养液重悬细胞，将细胞密度调至4×105/L，取100μL细胞悬液加入小室的上室，另将600μL含20%胎牛血清的 RPMI－1640培养液加入小室的下室，置培养箱中继续培养24 h取出Transwell小室，用棉签小心拭去滤膜上室面的细胞，常规HE染色，取下滤膜，粘于载玻片上，于倒置显微镜的高倍显微镜(×400)下随机选择5个视野，分别计数细胞数并取其平均值，以穿膜细胞数表示细胞的侵袭能力。实验重复3次，结果取其平均值。

3 统计学处理

采用SPSS 17．0软件进行统计分析，数据用均数±标准差(¯x±s)表示。组间差异用单因素方差分析进行统计，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 JEG－3细胞的siRNA的转染效率

荧光标记siRNA波长为470 nm，在绿色光下发红色荧光，以100 nmol/L的siRNA进行转染，其转染效率最高，见图1。

Figure 1．Results of JEG－3 cells transfected by siRNA labelled by fluorescence after 6 h by fluorescence microscopy( ×400)．A:the final concentration of siRNA was 100 nmol/L;B:the final concentration of siRNA was 50 nmol/L．图1 荧光显微镜下观察荧光标记的siRNA转染JEG－3细胞6 h

2 各组转染后细胞中PPARγ及MUC1 mRNA的表达情况

转染PPARγsiRNA后，S1组与空白对照组相比，PPARγmRNA 的表达水平下调了(40．88±1．05)%(P＜0.05)，S2组与空白对照组相比，下调了(71．92±0．71)%(P ＜0.05)，S3 组与空白对照组相比，下调了(62．69±0．66)%(P ＜0.05)，S4组与空白对照组相比，下调了(52．80±0．52)%(P＜0.05)。其中，S2组siRNA抑制效率最高，见图2。

Figure 2．Relative expression of PPARγmRNA in JEG－3 cells after transfection．¯x±s．n=15．*P＜0.05 vs negative control．图2 实时定量PCR测定各组细胞转染后PPARγmRNA的相对表达量

转染PPARγsiRNA后，实验组细胞中 PPARγ mRNA的表达水平与空白对照组相比下调了(75．0±0．8)%(P＜0.05)，阴性对照组与空白对照组则无显著差异(P＞0.05)，见图3。实验组细胞中MUC1 mRNA的表达水平与空白组相比下调了(65．0±1．3)%(P＜0.05)，阴性对照组与空白对照组则无显著差异(P＞0.05)，见图4。

Figure 3．Relative expression of PPARγmRNA in JEG－3 cells after transfection．¯x±s．n=9．*P＜0.05 vs other groups．图3 各组细胞转染后PPARγmRNA相对表达量

Figure 4．Relative expression of MUC1 mRNA in JEG－3 cells after transfection．¯x±s．n=9．*P＜0.05 vs other groups．图4 各组细胞转染后MUC1 mRNA相对表达量

3 各组转染后JEG－3细胞侵袭力的比较

高倍显微镜(×400)下，实验组穿膜细胞数为(47±4)个，阴性对照组的穿膜细胞数为(25±3)个，空白对照组的穿膜细胞数为(23±3)个，实验组穿膜细胞数与空白对照组的穿膜细胞数有显著差异(P＜0.05)，说明转染PPARγsiRNA后，细胞的侵袭力增强。阴性对照组与空白对照组的穿膜细胞数相比无显著差异(P ＜0.05)，见图5、6。

Figure 5．The invasion of JEG －3 cells24 h after transfection( ×400)．A:blank control group;B:negative control group;C:experiment group．图5 转染24 h后各组JEG－3细胞的侵袭力

Figure 6．The number of JEG－3 cells penetrating membrane 24 h after transfection．¯x±s．n=9．*P＜0.05 vs other groups．图6 转染24 h后各组JEG－3细胞的穿膜细胞数

讨 论

人类胚胎的着床、胎盘的形成以及胚胎的生长发育与滋养细胞的增殖、分化及侵袭功能有密切关系，受一系列复杂的、彼此联系的事件精密、严格地调控，其中滋养细胞对子宫内膜的合理侵入，以及着床后滋养细胞对子宫蜕膜层和肌层血管的侵袭，使子宫螺旋动脉发生血管重铸等生理现象，是决定妊娠正常与否的关键，并维持妊娠的正常进行。滋养细胞的侵袭能力受多种因素调控［7］:滋养细胞分泌合成一些细胞因子及生长因子通过诱导内皮细胞及血管平滑肌细胞的凋亡调节血管重铸过程、子宫螺旋动脉血流动力学、细胞外基质成分的改变、血管平滑肌细胞特性的变化以及局部免疫环境的变化。当这些因素平衡失调时，滋养细胞侵袭能力不足，子宫螺旋动脉血管重铸受阻，可能导致子痫前期、胎儿生长受限及自然流产的发生。目前为止，已有许多研究发现多种影响滋养细胞侵袭的因素及其在子痫前期等病理妊娠中的发病机制，探讨各种因子在滋养细胞侵袭能力的信号转导途径及其作用已成为目前病理妊娠研究的热点。

PPARs属于Ⅱ型核受体超家族成员，是近年来发现的一类核激素受体超家族成员。目前，已发现3种不同的PPARs亚型，分别为PPARα、PPARβ及PPARγ，这3种亚型在结构及功能上各有差异。其中，PPARγ有6个区域(A～F)，4个功能结构域:N末端的A/B结构区为非配体依赖性的转录活化区域，可通过MAPK途径被磷酸化，影响转录活性以及配基与受体结合;DNA结合结构域C区与启动子和目的基因结合，调节基因转录;转录活性调节结构域D区，是阻遏剂结合位点，许多核内因子与该结构域结合影响PPARγ活性;配体结合域E区;F为配体依赖性活化区。PPARγ须依赖于与其配体相结合，PPARγ被激活后与视磺酸受体(retinoic X receptor，RXR)结合形成异二聚体，再与过氧化物酶体增殖物反应元件(peroxisome proliferator responsive element，PPRE)结合，激活靶基因，从而调节基因转录、翻译及各种生物学效应［8－9］。PPARγ 处于各种信号转导途径的交叉点，参与了糖、脂肪代谢、单核细胞激活、炎症反应、细胞的分化、增生及凋亡等生理病理过程。其生物学功能复杂多样，须与相应配体结合后才能活化，产生生物学效应。

迄今，已有很多关于PPARγ与滋养细胞侵袭力方面的研究。Barak等［10］最早发现PPARγ在胎盘发育中的作用，在其研究中发现PPARγ基因敲除影响了孕鼠胎盘滋养细胞的终末分化以及胎盘血管发生变化。Asami－Miyagishi等［11］采用 RT－PCR 方法检测到在小鼠孕11 d时胎盘中即有PPARγmRNA的表达，在孕13 d时表达升高，之后则表达下降。免疫组化方法发现在孕鼠胎盘的母胎界面有PPARγ及其天然配体15－d－PGJ2的表达，说明PPARγ参与了胎盘的发育、发展过程。Fournier等［12］通过建立体外滋养细胞模型，用PPARγ的激活物抑制滋养细胞的侵袭力，并且检测到转化生长因子β(transforming growth factorβ，TGF－β)和妊娠相关血浆蛋白A(pregnancy－associated plasma protein－A，PAPP－A)的下调及白细胞介素－1β(interleukin－1β，IL－1β)的上调，因为这些因子可能与滋养细胞的侵袭有关，推测PPARγ可能通过以上途径影响滋养细胞侵袭能力。李淑娟等［13］利用早孕绒毛分离培养绒毛外滋养细胞模型，发现PPARγ的上调抑制了基质金属蛋白酶2、9(matrix metalloproteinase－2，9，MMP－2和 MMP－9)的表达，PPARγ抑制滋养细胞侵袭力可能与MMP－2、9有关。这些研究都表明PPARγ通过不同途径影响滋养细胞的侵袭能力。Shalom－Barak等［14］通过实验研究显示MUC1基因是 PPARγ的靶基因，PPARγ缺失的胎盘组织中MUC1的表达也缺失，PPARγ激动剂罗格列酮(rosiglitazone)可上调MUC1基因的表达，推断PPARγ可能通过调节MUC1调节胎盘的发育，另有研究发现，Shyu等［15］通过体外培养滋养细胞模型，发现MUC1的过表达能够下调MMP－9的表达，并抑制滋养细胞的侵袭能力。

因此本实验设计采用siRNA技术，能够特异性地抑制JEG－3细胞中PPARγ的表达，其mRNA抑制效率达(75．0±0．8)%，同时能够下调黏蛋白 MUC1 mRNA水平的表达(65．0±1．3)%。Transwell侵袭实验结果显示PPARγ的下调能够使滋养细胞的侵袭能力增强，这与之前的研究结果相一致，通过体外培养滋养细胞实验再一次验证了PPARγ能通过调节MUC1的表达影响滋养细胞的侵袭能力。

目前，国内外还没有关于通过抑制PPARγ下调滋养细胞中MUC1的表达影响滋养细胞侵袭力的研究，本研究验证了这一点。但是PPARγ对MUC1的具体调节机制目前还不清楚，尚待进一步研究。这些研究将为探索滋养细胞侵袭能力不足引起的子痫前期、胎儿生长受限及自然流产等病理妊娠的发病机制提供依据。

［1］ Harris LK，Keogh RJ，Wareing M，et al．Invasive trophoblasts stimulate vascular smooth muscle cell apoptosis by a Fas ligand－dependent mechanism［J］．Am JPathol，2006，169(5):1863－1874．

［2］ Pijnenborg R，Bland JM，Robertson WB，et al．Uteroplacental arterial changes related to interstitial trophoblast migration in early human pregnancy［J］．Placenta，1983，4(4):397－413．

［3］ Khong TY，De Wolf F，Robertson WB，et al．Inadequate maternal vascular response to placentation in pregnancies complicated by pre－eclampsia and by small－for－gestational age infants［J］．Br J Obstet Gynaecol，1986，93(10):1049－1059．

［4］ Zhou Y，Damsky CH，Fisher SJ．Preeclampsia is associated with failure of human cytotrophoblasts to mimic a vascular adhesion phenotype．One cause of defective endovascular invasion in this syndrome? ［J］．JClin Invest，1997，99(9):2152－2164．

［5］ Toth B，Bastug M，Mylonas I，et al．Peroxisome proliferator－activated receptor－gamma in normal human pregnancy and miscarriage［J］．Acta Histochemica，2009，111(4):373－379．

［6］ 李淑娟，尚 涛，李思扬，等．过氧化物酶体增殖型活化受体γ及其配体对早孕期细胞滋养细胞浸润能力的影响及机制研究［J］．中华医学杂志，2007，87(3):174－178．

［7］ Whitley GS，Cartwright JE．Cellular and molecular regulation of spiral artery remodelling:lessons from the cardiovascular field［J］．Placenta，2010，31(6):465 －474．

［8］ Vamecq J，Latruffe N．Medical significance of peroxisome proliferator－ activated receptors［J］．Lancet，1999，354(9173):141－148．

［9］ Willson TM，Brown PJ，Sternbach DD，et al．The PPARs:from orphan receptors to drug discovery［J］．J Med Chem，2000，43(4):527－550．

［10］ Barak Y，Nelson MC，Ong ES，et al．PPARγ is required for placental ，cardiac，and adipose tissue development［J］．Mol Cell，1999，4(4):585 －595．

［11］ Asami－Miyagishi R，Iseki S，Usui M，et al．Expression and function of PPARγ in rat placental development［J］．Biochem Biophys Res Commun，2004，315(2):497－501．

［12］ Fournier T ，Handschuh K，Tsatsaris V，et al．Involvement of PPARγ in human trophoblast invasion［J］．Placenta，2007，28(Suppl A):S76－S81．

［13］ 李淑娟，尚 涛，李秋玲，等．过氧化物酶体增殖物激活型受体γ及其配体对早期细胞滋养细胞MMP－2、MMP－9表达的调控［J］．生殖与避孕，2007，27(2):107－112．

［14］ Shalom －Barak T，Nicholas JM，Wang Y，et al．Peroxisome proliferator－activated receptor gamma controls Muc1 transcription in trophoblasts［J］．Mol Cell Biol，2004，24(24):10661－10669．

［15］ Shyu MK，Lin MC，Liu CH，et al．MUC1 expression is increased during human placental development and suppresses trophoblast－like cell invasion in vitro［J］．Biol Reprod，2008，79(2):233 －239．