微管相关蛋白2和巢蛋白在人胚胎小肠中的表达*

刘学红, 张 泳

(绍兴文理学院医学院 1组织学与胚胎学教研室，2医学实验中心,浙江 绍兴 312000)

1000-4718(2012)03-0553-03

2011-08-29

2011-12-31

浙江省教育厅科研计划项目(No.Y201018535)；绍兴文理学院重点项目(No.2010LG1011)

△通讯作者 Tel:0575-88345099； E-mail:lxh6588@yahoo.com.cn

微管相关蛋白2和巢蛋白在人胚胎小肠中的表达*

刘学红1△, 张 泳2

(绍兴文理学院医学院1组织学与胚胎学教研室，2医学实验中心,浙江 绍兴 312000)

目的探讨微管相关蛋白2(MAP-2)和巢蛋白(nestin)与人胚胎小肠壁组织发育的关系。方法应用免疫组织化学PV法和图像分析(NIS-DR)软件检测第2、3、4个月龄段，人胚胎小肠组织内MAP-2和nestin的表达分布规律，数据的组间比较采用单因素方差分析。结果第2、3、4个月龄段，MAP-2主要表达于人胚胎小肠壁黏膜下和肌间神经丛内神经细胞和纤维，随胎龄的增大，肌间神经丛内神经细胞的阳性强度增强, 两两比较, 差异有统计学意义(P<0.05)。Nestin蛋白在小肠壁各层均有阳性表达，其黏膜下层和肌间神经丛内阳性细胞数量随胎龄增大而呈先增高再降低的趋势，两两比较, 差异有统计学意义(P<0.05)。结论MAP-2和nestin参与调节人胚胎小肠壁组织的生长发育过程。

小肠； 微管相关蛋白2； 巢蛋白； 人胚胎

巢蛋白(nestin) 和微管相关蛋白2 (microtubule-associated protein 2，MAP-2)均属于细胞骨架蛋白，其表达分布规律反映细胞的分化、生长发育及增殖能力。目前微管蛋白和巢蛋白在动物和人中枢神经系统组织中的分布及病理作用机制研究较多[1-4]，但关于它们在人胚胎小肠壁发育过程中的表达、分布规律国内外文献报道甚少。本文通过研究人胚胎小肠壁组织细胞生长发育过程中微管蛋白和巢蛋白的表达状况，探讨两者在小肠壁组织细胞分化、发育过程中的分布规律及其作用，为先天性小肠疾病研究提供形态结构基础和理论依据。

材 料 和 方 法

1胚胎收集与分组

收集因意外原因造成人工流产、发育正常的人胚胎标本16例(每例标本均取得产妇本人同意和院伦理委员会审批)。根据产妇末次月经、B超所测胎儿双顶径和人胚胎形态学特征等确定胎龄为7～16周。以每4周为一月龄组，每月龄为一研究组，其例数分布如下：第2个月龄组5例，第3个月龄组6例，第4个月龄5例。

2取材和免疫组织化学染色程序

从胎尸内取出小肠标本，分别从每例标本中切取肠管长约1.0 cm，用4 ℃生理盐水冲洗肠管，放入10%的中性甲醛水溶液中固定12 h后，取出流水冲洗30 min，行常规脱水、透明、浸蜡和包埋。石蜡切片，片厚4 μm，每个标本取4片，行免疫组织化学染色(所用试剂MAP-2和nestin Ⅰ抗(小鼠抗人)及其辅助试剂盒均购于北京中杉金桥生物技术有限公司)。免疫组化染色采用PV法：即切片常规脱蜡至水→微波抗原修复→3%H2O2灭活内源性酶→滴加Ⅰ抗(抗体浓度为1∶150)→PV6002→DAB显色(在以上各步之间均用PBS洗涤5 min×3次)→苏木精轻度复染，然后脱水，透明，中性树胶封片，显微镜观察。

3对照实验

用PBS替代Ⅰ抗、Ⅱ抗作阴性对照，用已知阳性片作阳性对照。

4图像分析及统计学处理

结 果

切片经染色后，MAP-2和nestin阳性细胞的细胞质/膜呈淡黄色、黄色或深黄色，细胞核不着色。第2～4月龄段，nestin蛋白在小肠绒毛间质细胞、黏膜下及肌层血管内皮细胞、神经丛内部分神经细胞呈阳性表达，黏膜上皮和肠腺呈阴性表达，见图1。随着胎龄的增大，黏膜下层及肌间神经丛内nestin蛋白表达阳性细胞数量呈先增高再降低的趋势,其差异有统计学意义(P<0.05), 见表1。

MAP-2主要表达于人胚胎小肠壁黏膜下和肌间神经丛内神经细胞、神经胶质细胞和它们相连的神经纤维,见图2。随胎龄的增大，肌间神经丛内神经细胞的阳性强度增强, 其差异有统计学意义(P<0.05), 见表2。

Figure 1. Expression of nestin protein in the small intestinal intermuscular nerve plexus and submucosal plexus at the 2nd to 4th months of fetal age(immunohistochemical staining,×400)↑:positive expression.A: 2 months; B:3 months; C:4 months.

图1人胎第2～4个月龄时，巢蛋白在黏膜下和肌间神经丛中的表达

Figure 2. The MAP-2 expression in the small intestinal intermusculer nerve plexus at the 2nd to 4th months of fetal age(immunohistochemical staining, ×400).↑:intensively positive expression.A:2 months; B: 3 months; C:4 months.

图2人胎第2～4个月龄时，MAP-2蛋白在小肠肌间神经丛中的表达

讨 论

在人胚胎形成的第7周，小肠由中肠发育、分化、演变而成，此期，小肠四层结构已形成。正常小孩和成人胃肠道内存在神经内分泌系统，俗称胃肠小脑，它作为周围神经系统的一部分，调控胃肠道正常蠕动等各种生理功能。目前临床许多难治性胃肠功能紊乱性疾病均与胃肠道的神经内分泌系统异常有关。研究胃肠道神经系统神经细胞的发生、演变规律，对深入研究胃肠道神经功能失调及先天发育异常具有重要意义。据报道，巢蛋白为第Ⅵ类中间丝蛋白,参与调节细胞骨架形成、细胞信号转导、组织器官发生，代表干细胞增殖、迁移、分化的特性，是神经干细胞的标志性蛋白，被广泛用于研究人和哺乳动物中枢和周围神经系统内神经细胞的分化、发育及演变规律[5-9]。MAP-2是细胞骨架系统重要成分之一 ，主要存在于神经元的胞体和突起中。MAP-2在神经元的生长和发育、突起的形成和生长、细胞器运输及信号转导等方面起到重要作用[10-11]。本实验结果显示，第2～4月龄段，nestin蛋白在小肠绒毛间质、黏膜下及肌层血管内皮细胞、神经丛内部分神经细胞胞质呈阳性表达，黏膜上皮和肠腺呈阴性表达。随着胎龄的增大，黏膜下层及肌间神经丛内nestin蛋白表达阳性细胞数量呈先增高再降低的趋势。MAP-2主要表达于人胚胎小肠壁黏膜下和肌间神经丛内神经细胞、神经胶质细胞和它们相连的神经纤维。随胎龄的增大，肌间神经丛内神经细胞的阳性强度增强。这说明在胚胎发育的早期阶段，小肠壁在2个月龄尚处于生长发育形成期，肠壁组织细胞生长速度相对较慢，大部分细胞在此期处于静止期，细胞积蓄能量，为第3个月龄段小肠壁组织的快速增长做准备。到了第3个月龄段，小肠为适应机体生长发育的需要，生长速度较前明显加快，肠壁组织细胞大量增殖，肠壁内大量血管和神经细胞形成和增生，为满足小肠壁增厚、增长的生理需要提供营养和信息保障。此期，肠壁内原先处于静止期的干细胞进入增殖、分化阶段，使巢蛋白表达阳性细胞数量较前增多。随着胎龄增大，第3个月龄段肠壁组织细胞的快速增殖，到了第4个月龄，小肠壁大部分组织细胞发育接近成熟，细胞骨架成分基本发育完善，肌细胞也由活跃的增殖期逐渐转为静止期，细胞增殖能力下降，nestin表达趋于减弱，甚至消失，而MAP-2阳性表达逐渐增强。这与nestin和MAP-2的生物学特性有关，即巢蛋白在干细胞中的表达通常为一过性, 当组织分化成熟时, 巢蛋白的表达即消失。而MAP-2则是神经元成熟发育的重要标志物之一，其阳性表达强度反映神经细胞发育成熟度和细胞内微管组装活动度。钱军等[12]通过实验也证实MAP-2的高表达可能在脊髓损伤后突触结构的重建及受损神经功能代偿和修复中发挥重要作用。Cantarero等[13]报道nestin在大鼠十二指肠壁的表达分布规律与本研究结果基本一致，说明人和大鼠肠壁干细胞的分化发育机理存在一致性。

表1Nestin在第2～4个月龄段人胚胎小肠黏膜下层及肌间神经丛内阳性细胞数

GroupnNestinpositivecellcount2months520.0000±7.6594*3months638.1304±14.95844months532.9375±10.0696*

*P<0.05vs3 months.

表2MAP-2在第2～4个月龄段人胚胎小肠肌间神经丛内阳性表达强度

GroupnMAP-2positivecellintensity2months590.7888±9.4122*3months691.2775±3.565304months596.9577±4.4002*

*P<0.05vs3 months.

因此，我们认为在人胚胎早期生长发育过程中，MAP-2和nestin参与了调控小肠壁组织细胞分化、发育过程。

[1] 李俊岑，丁培培，刘姿辰，等. 神经前体细胞巢蛋白在大鼠脊髓损伤后的表达[J].中国康复医学杂志，2010, 25(9)：833-837.

[2] Zhang P, Li J, Liu Y, et al. Transplanted human embryonic neural stem cells survive, migrate, differentiate and increase endogenous nestin expression in adult rat cortical peri-infarction zone[J]. Neuropathology, 2009, 29(4): 410-421.

[3] Santilli G, Lamorte G, Carlessi L, et al. Mild hypoxia enhances proliferation and multipotency of human neural stem cells[J]. PLoS One, 2010, 5(1):e8575.

[4] van Velthoven CT, Kavelaars A, van Bel F, et al. Repeated mesenchymal stem cell treatment after neonatal hypoxia-ischemia has distinct effects on formation and maturation of new neurons and oligodendrocytes leading to restoration of damage, corticospinal motor tract activity, and sensorimotor function[J]. J Neurosci,2010, 30(28):9603-9611.

[5] Zhang M, Song T, Yang L,et al.Nestin and CD133: valuable stem cell-specific markers for determining clinical outcome of glioma patients[J].J Exp Clin Cancer Res,2008,27(1):85-91.

[6] Hendrickson ML, Rao AJ, Demerdash ON, et al. Expression of nestin by neural cells in the adult rat and human brain[J]. PLoS One, 2011, 6(4): e18535.

[7] Yang KM, Yong W, Li AD, et al. Insulin-producing cells are bi-potential and differentiators prior to proliferation in early human development[J]. World J Diabetes,2011,2(4):54-58.

[8] Su PH, Wang TC, Wong ZR, et al. The expression of Nestin delineates skeletal muscle differentiation in the developing rat esophagus[J]. J Anat,2011, 218(3):311-323.

[9] 张 泳, 刘学红. 微管相关蛋白2、巢蛋白与人胚胎食管肌层发育的关系[J].中国病理生理杂志, 2011, 27(10):2024-2026,

[10]Burtelow MA, Longacre TA. Utility of microtubule associated protein-2 (MAP-2) immunohistochemistry for identification of ganglion cells in paraffin-embedded rectal suction biopsies[J]. Am J Surg Pathol, 2009, 33(7):1025-1030.

[11]Lin Z, Gao N, Hu HZ, et al. Immunoreactivity of Hu proteins facilitates identification of myenteric neurones in guinea-pig small intestine[J]. Neurogastroenterol Motil, 2002,14(2):197-204.

[12]钱 军，孙正义，马延超，等. 大鼠脊髓损伤后MAP-2的表达及与运动功能恢复的相关性[J]．西安交通大学学报：医学版，2006,27(5)：489-492.

[13]Cantarero-Carmona I, Luesma-Bartolomé MJ, Lavoie-Gagnon C, et al. Distribution of Nestin protein: immunohistochemical study in enteric plexus of rat duodenum[J]. Microsc Res Tech, 2011, 74(2):148-152.

Expressionofmicrotubule-associatedprotein2andnestininsmallintestinetissuesofhumanembryos

LIU Xue-hong1, ZHANG Yong2

(1DepartmentofHistologyandEmbryology,2MedicalLaboratoryCenter,MedicalCollege,ShaoxingUniversity,Shaoxing312000,China.E-mail:lxh6588@yahoo.com.cn)

AIM: To explore the relationship between expression of microtubule-associated protein 2 (MAP-2)/nestin and development of small intestine in human embryos.METHODSThe expression of MAP-2 and nestin proteins was detected in the second, third and fourth months of fetal human embryonic small intestinal tissues by the PV method of immunohistochemistry. The positive cell counts and positive intensities were analyzed with Nikon imaging system (NIS-DR). One-way ANOVA was applied to compare these positive cell counts and positive intensities.RESULTSAt the second, the third and the fourth month of human embryos, MAP-2 positive expression was observed in the neural cells and neural fibers of the intermuscular nerve plexus and submucosal plexus in the developing small intestines. With the fetal age increasing, the expressive intensity of MAP-2 positive cells in the neural tissues of the intermuscular nerve plexus showed an uptrend. The results of positive intensity values of the MAP-2 positive cells detected in the 3 fetal age periods showed significant difference (P<0.05). Nestin positive expression was seen in all layers of the small intestine, and the number of positive cells was first increased and then decreased in the developing small intestines of human embryos with the increasing fetal age. One-way ANOVA results also showed significant difference (P<0.05).CONCLUSIONMAP-2 and nestin regulate the development of small intestinal tissues in human embryos.

Intestine, small; Microtubule-associated protein 2; Nestin; Human embryo

R329.1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.03.031