天花粉中瓜氨酸与γ-氨基丁酸的含量测定

2012-11-06陈文秋余敏灵

中国药业 2012年4期

刘文，陈文秋，潘健，余敏灵

(四川省乐山市食品药品检验所，四川乐山 614000)

天花粉为葫芦科植物栝楼 Trichosantheskirilowii Maxim.的干燥根，收载于2010年版《中国药典(一部)》[1]，是一种富含氨基酸的中药材[2]。其所含的瓜氨酸在人体的氨基酸、蛋白质代谢中有较重要的作用;γ-氨基丁酸也具有多种生理作用，如临时性降压作用，对胰腺癌细胞SW1990细胞的生长及血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响，以及作为哺乳动物摄食和味觉的调控因子等[3-5]。因此，测定天花粉中的瓜氨酸与γ-氨基丁酸含量对于评价其质量有一定的意义，但尚未见有同时测定天花粉中两组分含量的相关文献。为此，笔者采用了柱前衍生反相高效液相色谱(RP-HPLC)法对天花粉中瓜氨酸与γ-氨基丁酸含量进行了同时测定，现报道如下。

1 仪器与试药

美国Waters2695型高效液相色谱仪，包括2487型紫外检测器，Empower色谱工作站;美国Varian Cary100型紫外可见分光光度计。瓜氨酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号为875-200003);γ-氨基丁酸(成都市科龙化工试剂厂，批号为20021101);异硫氰酸苯酯(北京北分瑞利＜集团＞有限公司，批号为AAD06001);乙腈(上海陆都化学试剂厂，色谱纯);其余试剂均为分析纯;天花粉(乐山康发药业股份有限公司，批号为1000302，1000509，1000706)，按 2005 年版《中国药典(一部)》鉴定，植物来源为葫芦科植物栝楼 Trichosanthes kirilowii Maxim.的干燥根。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

精密称取瓜氨酸对照品186.0 mg，γ-氨基丁酸对照品515.2 mg，分置两个200 mL量瓶中，加盐酸溶液(0.1 mol/L)适量使溶解后，加盐酸溶液至刻度，摇匀，作为瓜氨酸对照品贮备液和γ-氨基丁酸对照品贮备液;精密量取上述贮备液各10 mL，置100 mL量瓶中，加盐酸溶液(0.1 mol/L)稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。取天花粉(批号为1000302)适量粉碎后，混匀，精密称取3.0618g，置具塞锥形瓶中，分别加80%的甲醇溶液100，100，50，50 mL，提取4次，每次60℃超声振摇20 min，合并甲醇溶液，水浴蒸干，残渣用盐酸溶液(0.1 mol/L)溶解并转移至50 mL量瓶中，用盐酸溶液(0.1 mol/L)稀释至刻度，摇匀，作为供试品贮备液。

2.2 样品衍生化

精密量取供试品贮备液适量(10～400μL)，置1 mL量瓶中，加异硫氰酸苯酯-乙腈溶液(25μL∶2 mL)200μL，加三乙胺-乙腈溶液(1.4∶8.6)稀释至刻度，摇匀，放置1 h，转移至试管中，加正己烷1 mL，振摇，分取下层液体，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.3 检测波长选择

取对照品贮备液100μL，按2.2项下方法衍生化后，取续滤液于200～400 nm波长范围内扫描。结果该溶液在248 nm波长处有最大吸收，故选择248 nm作为检测波长。

2.4 色谱条件

色谱柱:Venusil-AA氨基酸分析柱(250 mm×4.6 mm，5μm);流动相:A为0.05 mol/L醋酸钠溶液(pH=6.5)，B为乙腈-水(80∶20)梯度洗脱(见表1);流速:1.00 mL/min;检测波长:248 nm;柱温:25℃;进样量:10μL。

表1 流动相梯度洗脱表

2.5 方法学考察

系统适用性试验:分别取供试品贮备液100μL和对照品贮备液100μL，按2.2项下方法衍生化后，取续滤液照2.4项下色谱条件分别进样，色谱图见图1。供试品溶液色谱图中，有与对照品溶液色谱图中瓜氨酸与γ-氨基丁酸色谱峰相对应的色谱峰，且与其他色谱峰有较好的分离度，分离度大于1.5，理论板数均大于3 000。另取盐酸溶液(0.1 mol/L)100μL，按2.2项下方法衍生化后，滤过，作为空白对照溶液，照2.4项下色谱条件分别进样，结果空白对照溶液无相应色谱峰。

线性关系考察:精密量取对照品贮备液10，100，200，300，400μL分别置1 mL量瓶中，按2.2项下方法衍生化后，取续滤液，照2.4项下色谱条件测定。以氨基酸质量浓度(C，μg/mL)与色谱峰面积(A)进行线性回归，得回归方程瓜氨酸 A=70 367 C-121.8，r=0.999 7(n=5);γ-氨基丁酸 A=54 316 C-92.7，r=0.999 6(n=5)。结果表明，瓜氨酸与γ-氨基丁酸的进样量分别在9.30～372.00 ng与25.76～1 030.40 ng范围内与各自峰面积呈良好的线性关系。

图1 高效液相色谱图

精密度试验:精密量取对照品贮备液100μL，按2.2项下方法衍生化后，取续滤液，照2.4项下色谱条件连续进样5次。结果瓜氨酸与γ-氨基丁酸色谱峰面积平均值分别为654 410和1 399 020，RSD分别为1.5%和1.2%(n=5)，表明方法的精密度良好。

重复性试验:精密量取供试品贮备液100μL共6份，分别置6个1 mL量瓶中，按2.2项下方法衍生化后，取续滤液，照2.4项下色谱条件测定。结果瓜氨酸与γ-氨基丁酸色谱峰面积平均值分别为1 443 979和238 122，RSD分别为1.6%和1.0%(n=6)，表明方法重复性良好。

稳定性试验:取2.1项下供试品贮备液100μL，按2.2项下方法衍生化后，取续滤液，照2.4项下色谱条件分别于0，1，2，6，12 h时进样，测定峰面积。结果瓜氨酸与γ-氨基丁酸峰面积的RSD分别为1.6%与1.2%(n=5)，表明被测溶液在室温条件下12 h内稳定，能满足含量测定要求。

加样回收试验:取已知含量的天花粉(批号为1000302)适量粉碎后，混匀，精密称取细粉9份(每份约1.5 g)，分别置9个具塞锥形瓶中，精密加入瓜氨酸对照品贮备液 4.4，4.4，4.4，5.5，5.5，5.5，6.6，6.6，6.6 mL 和 γ -氨基丁酸贮备液 0.33，0.33，0.33，0.41，0.41，0.41，0.49，0.49，0.49 mL，照供试品贮备液制备方法制备溶液，滤过，取续滤液100μL，按2.2项下方法衍生化后，取续滤液，照2.4项下色谱条件测定，计算含量和加样回收率。结果见表2。