高效液相色谱法同时测定双黄消炎片中黄芩苷和黄芩素含量

徐占方，陈立柱，姜雪敏，孙 菲

(黑龙江省鸡西市药品检验所，黑龙江 鸡西 158100)

双黄消炎片由三颗针、黄芩两味中药组方，具有消炎之功效[1]，可用于咽喉痛、腹泻、痢疾、慢性痢疾等症，现行质量标准只有显微鉴别和黄酮类化合物的定性鉴别，无对黄芩主要成分的定量检测，无法有效控制产品的质量。黄芩质量好坏直接影响药品的疗效，黄芩的主要成分有黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素[2]。对双黄消炎片中黄芩苷的高效液相色谱(HPLC)法测定已有报道[3-5]，但仅用黄芩苷一种成分的含量不能全面地反映黄芩的质量。笔者建立了可同时测定双黄消炎片中黄芩苷、黄芩素两种主要成分含量的高效液相色谱法，报道如下。

1 仪器和试药

HP1100型高效液相色谱仪，HP1100型工作站(自动进样，紫外检测器);Sartorius电子天平;KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器;TU-1901型双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。黄芩苷对照品(批号为110715-200815，含量为95.2%)，黄芩素对照品(批号为111595-200604)，均购自中国药品生物制品检定所;双黄消炎片(市售样品3批，批号分别为20100924和20100305，通化万通药业有限公司;批号为20080701，吉林省俊宏药业有限公司);其他试剂均为色谱纯。

2 方法和结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Agilent Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm);以甲醇(A)-0.4%磷酸溶液(B)为流动相梯度洗脱，40%A(0 min)，80%A(40 min)，40%A(60 min);检测波长:277 nm;流速:1.0 mL/min;进样量:10μL;柱温:30℃。在此条件下，理论板数不低于5 000，色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

2.2 溶液制备

精密称取样品适量(约相当于平均片重)，置50 mL容量瓶中，加70%乙醇40 mL，超声提取40 min，放置至室温，加70%乙醇至刻度，摇匀，滤过，精密吸取5 mL，置20 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得供试品溶液。分别精密称取经P2O5干燥过夜的黄芩苷对照品29.82 mg和黄芩素对照品10.61 mg，置同一50 mL容量瓶中，加甲醇适量，超声使溶解，用甲醇稀释至刻度，滤过，作为对照品贮备液。按双黄消炎片的处方、制法项下不加黄芩粉末，制备阴性样品，按供试品溶液制备的方法制成阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

线性关系考察:分别精密量取黄芩苷、黄芩素对照品贮备液1.0和0.5 mL，置同一10 mL量瓶中，加70%乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，按上述色谱条件，分别进样 1，2.5，5，10，15，20，25μL，以峰面积 Y对质量浓度 X(μg/mL)进行回归分析。黄芩苷回归方程为 Y=37.45X+11.84，r=1.000 0(n=7)，黄芩苷质量浓度在5.678～142.0μg/mL范围内与峰面积线性关系良好;黄芩素回归方程为 Y=61.55X-1.691，r=1.000 0(n=7)，黄芩素质量浓度在2.122～53.05μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验:取对照品溶液(含黄芩苷56.78μg/mL，黄芩素21.22μg/ml)，重复进样5次。结果黄芩苷和黄芩素峰面积值的RSD分别为0.1%和0.3%(n=5)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验:精密吸取同一供试品溶液，分别在 0，2，4，8，12，16，24 h时重复进样。结果黄芩苷和黄芩素峰面积的 RSD分别为0.6%和0.7%(n=7)，表明供试品溶液在24 h内稳定。

重复性试验:分别精密称取同一样品(批号为20080701)5份，依法制备供试品溶液并测定。结果黄芩苷和黄芩素平均含量分别为29.53 mg/g和9.053 mg/g，RSD分别1.2%和1.1%(n=5)，表明方法重复性较好。

加样回收试验:取已知含量的样品(批号为20080701，平均片重为0.401 2 g)约0.2 g共6份，精密称定，分别置50 mL容量瓶中，分别精密加入对照品溶液(含黄芩苷2 917μg/mL和黄芩素 909 μg/mL)2.4，2.4，2.0，2.0，1.6，1.6 mL，加 70%乙醇溶液适量，超声40 min，放至室温，用70%乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，精密吸取5 mL，置20 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，用微孔滤膜滤过，进样10μL，测定含量，计算回收率。结果见表1。

2.4 样品含量测定

取本品10片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于平均片重)，按2.2项下方法制备供试品溶液。按拟订的色谱条件进样10μL，按峰面积外标法测定含量。结果见表2。

表1 加样回收试验结果(n=6)

表2 样品含量测定结果(n=3)

3 讨论

分别取黄芩苷和黄芩素对照品适量，用流动相稀释到一定的质量浓度，照紫外分光光度法，在200～700 nm波长范围内扫描。结果黄芩苷、黄芩素的最大吸收波长分别是279 nm和277 nm，但在277 nm处黄芩苷和黄芩素分离效果好，故将测定波长确定为277 nm。

为在相对较短的时间内获得满意的分离效果，故采用梯度洗脱，色谱柱选用250 mm的长柱。流动相开始采用磷酸盐缓冲液-乙腈，黄芩苷和黄芩素分离效果不理想，采用甲醇和磷酸溶液定，梯度洗脱后取得了较好的分离效果。

在试验过程中，考察了单纯用甲醇超声30 min提取、70%乙醇超声30 min提取、70%乙醇加热回流3 h提取的效果，结果表明，用甲醇超声提取黄芩苷提取不完全，加热回流方法虽提取得彻底但比较费时费力，最终选用70%乙醇超声40 min提取。几种方法提取黄芩苷的差异较大。

本品的现行质量标准控制水平较低，仅对双黄消炎片中黄芩有显微鉴别，没有黄芩主要成分的定量检测。这给不法分子以可乘之机，以次充好，降低生产成本，但却影响了药品的疗效。而且在实际的监督中，药品检验部门按现行标准检验，只能出具合格报告书，不能定其为不合格产品。本含量测定方法的建立，对现行标准是有效的补充和提高。

[1]WS3-B-0235-90.中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂(第二册)[S].

[2]南京中医药大学.中药大辞典(下册)[M].第2版.上海:上海科学技术出版社，2006:2 806.

[3]莫海涛，刘 元，宋志钊.HPLC测定双黄消炎片中黄芩苷含量[J].中国民族民间医药，2009，18(17):24-25.

[4]宋吉莲，吕凤莲，袁明辉.HPLC测定双黄消炎片中黄芩苷含量[J].中国药事，2005，19(11):47-48.

[5]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:化学工业出版社，2005:212.