吡格列酮和高脂喂养对SD大鼠SIRT6表达的影响
2012-11-06章建梅韩俊峰陆俊茜刘若冰贾伟平
章建梅 徐 淼 韩俊峰 陆俊茜 刘若冰 魏 丽 贾伟平
SIRT6由Fyre1999年发现,是一种在哺乳动物的多个组织中广泛表达的细胞因子,为组蛋白H3K9去乙酰化酶和ADP-核糖基转移酶,具有抗衰老、抑制炎症等作用[1~4]。新近的研究发现其与糖脂代谢密切相关,而对其的调控研究却知之甚少。关于糖脂代谢异常是否会引起SIRT6表达的改变及治疗糖脂代谢异常的药物又是否影响SIRT6目前研究较少。本研究拟通过高脂喂养建立肥胖SD大鼠模型并用吡格列酮干预来观察SIRT6表达的改变,观察高脂和PPAR-γ激动剂对SIRT6表达的影响,为深入了解SIRT6的调控机制提供依据。
材料与方法
1.动物模型的建立及分组:8周龄、体重约200g雄性清洁级SD大鼠(上海西普尔-必凯实验动物有限公司)24只适应性喂养1周后随机分为:普通对照组(NC)8只,高脂组16只。每周记录体重、摄食量和饮水量。NC组给予普通饲料,高脂组给予高脂饲料。普通饲料总热量为380kJ/100g,其中糖类占55%,脂肪占24%,蛋白质占21%。高脂饲料总热量为520kJ/100g,其中糖类占20%,脂肪占59%,蛋白质占21%。高脂组喂养8周后,再随机分为两组:高脂饮食组(HF)和吡格列酮(日本武田公司)治疗组(FP),每组8只。FP组予吡格列酮20mg/(kg·d)灌胃,NC组和HF组相应予溶剂灌胃,灌胃 4 周[5]。
2.标本收集及处理:12周后处死大鼠,死前静脉采血,收集血清,-80℃保存待测。摘取附睾周围脂肪、肝脏以及肌肉组织,-80℃保存备用。
3.大鼠血脂、血糖的测定:大鼠禁食12h后空腹血糖由强生血糖仪测尾尖血两次取平均值获得,空腹胰岛素采用酶联免疫法(mercodia公司)。Glamour 2000全自动检测分析仪测定胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。
4.RT-PCR:Trizol(Invitrogen公司)法提取总 RNA,反转录为cDNA(Epicentre公司反转录试剂盒)。根据SIRT6和管家基因18S的基因序列,设定上、下游引物。SIRT6:上游引物5'-gccgtctggtcattgtca-3',下游引物 5'-agccttgggtgctactgg-3'(191bp);18S:上游引物 5'- gtaacccgttgaaccccatt-3',下游引物5'-ccatccaatcggtagtagcg-3'(151bp)。SIRT6的反应条件:95℃预变性 5min,95℃ 变性 30s,56℃ 退火 30s,72℃ 延伸40s,30个循环,72℃延伸10min。18S的反应条件:95℃预变性 5min,95℃变性 30s,60℃退火 30s,72℃延伸 40s,30 个循环,72℃ 延伸10min。PCR产物经电泳分析鉴定,凝胶成像后结果应用灰度扫描仪分析SIRT6与对应的18S条带灰度的比值表示SIRT6的相对表达量。
5.Western blot:用RIPA裂解液提取组织蛋白,取80μg蛋白质样品上样,电泳及转膜。膜与SIRT6抗体(abcam公司)1∶1000、β -actin 抗体1∶800、ERK 抗体1∶1000,4℃过夜。Ⅱ抗(1∶2500)室温下与膜进行杂交1h。ECL显色,摄取图像。应用灰度扫描仪分析SIRT6与对应的β-actin/erk条带灰度的比值表示其相对表达量。
6.统计学方法:应用SPSS 16.0统计软件,所有数据以均数±标准差(x±s)表示,用配对t检验及单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
1.各组大鼠体脂和血脂谱差异:12周后,HF组大鼠体重、FINS、FBG、TC、TG 和 LDL-C 均明显高于NC组(P均<0.05),HDL-C较NC组明显下降(P<0.01)。与HF组相比,FP组大鼠体重、FINS、FBG、TC、TG、LDL-C均下降,差异有显著性(P均<0.05,表1)。
2.高脂和吡格列酮对SIRT6表达的影响:SIRT6在大鼠附睾脂肪、肝脏及肌肉组织均有表达。与NC组相比,HF组大鼠附睾脂肪、肝脏、肌肉组织中的SIRT6蛋白及mRNA轻度下降。而吡格列酮治疗后,大鼠附睾脂肪、肝脏、肌肉组织中的SIRT6 mRNA与HF组相比分别上升1.51倍、2.07倍、1.72倍(P <0.05);大鼠附睾脂肪、肝脏、肌肉组织中的SIRT6蛋白与HF组相比分别上升1.44倍、1.89倍、1.33倍(P <0.05,图1、图2)。
表1 各组间大鼠体重和血生化指标的比较(x±s)
讨 论
肥胖是体内脂肪,尤其是甘油三酯积聚过多而导致的一种状态,肥胖者的细胞肥大且数量增多,可导致某些激素的表达增强或减弱,从不同层次影响糖脂代谢,形成糖脂代谢紊乱。SIRT6是一种由355个氨基酸残基组成的核蛋白,基因定位于19p13.3,它跨越了8427bp的区域,由8个外显子和7个内含子组成[1]。Mostoslavsky等[2]发现 SIRT6 基因缺陷小鼠产后四周表现为皮下脂肪减少、低血IGF-1及致死性血糖。Zhong等[3]的研究发现,SIRT6敲除使得糖酵解关键酶启动子上组蛋白乙酰化,使DNA与组蛋白结合松弛,从而促进这些酶转录活性增加,使血糖进入外周组织细胞参与糖酵解,引起血糖降低。Kim等[4]观察到,肝脏特异性SIRT6敲除的小鼠脂肪合成增加而氧化减少,最终小鼠发展为脂肪肝。另一方面Kanfi等[5]也发现过表达SIRT6可抑制高脂饮食引起的肥胖,提示SIRT6参与糖脂代谢的调节。目前对SIRT6的表达调控方面的研究较少。我们知道SIRT6对糖脂代谢有着重要的作用,而吡格列酮是治疗糖脂代谢异常的常用药物。吡格列酮为PPAR-γ激动剂,通过激动PPAR-γ对许多基因起着调控作用。因此我们观察了高脂和PPAR-γ对SIRT6表达的影响。
本研究发现高脂饲喂后大鼠的体重、FINS、FBG、TC、TG和LDL-C均明显升高(P <0.05),HDL-C则明显下降,而吡格列酮干预后大鼠的体重、FINS、FBG、TC、TG和LDL-C均下降,差异有显著性(P<0.05)。提示吡格列酮除具有明显降糖作用外,还具有明显的调脂作用。
研究显示热量限制或禁食后SIRT6表达明显升高,但高脂对SIRT6表达的影响尚有争议:如有研究显示高脂饮食大鼠SIRT6蛋白轻度降低;而Palmer等[6]却发现高脂饮食小鼠SIRT6蛋白明显下降(P<0.05)。本研究发现高脂喂养后,虽然大鼠附睾脂肪、肝脏及肌肉组织中SIRT6蛋白和mRNA表达有所下降,但没有显著性差异,推测高脂对SIRT6的影响可能存在种属间差异。
我们的实验结果显示PPAR-γ可以上调大鼠附睾脂肪、肝脏、肌肉组织中的SIRT6 mRNA和蛋白的表达。PPAR-γ激动剂吡格列酮治疗后,大鼠附睾脂肪、肝脏、肌肉组织中的SIRT6 mRNA与HF组相比分别上升1.51倍、2.07倍、1.72倍(P<0.05)。而大鼠附睾脂肪、肝脏、肌肉组织中的SIRT6蛋白与 HF组相比分别上升1.44倍、1.89倍、1.33倍(P<0.05)。本实验发现吡格列酮可从mRNA及蛋白水平影响SIRT6的表达,推测吡格列酮的降糖、调脂作用可能经由上调SIRT6的表达来起作用的。本实验结果还发现吡格列酮治疗后肝脏组织SIRT6 mRNA及蛋白上升最显著,推测吡格列酮主要上调肝脏SIRT6影响肝脏糖脂代谢从而起着降糖调脂的作用。Yang等[7]的实验也显示罗格列酮可改善肝纤维化,促进OLETF小鼠肝脏SIRT6表达,本实验结果与其一致。Kim等[4]的实验结果也提示肝脏特异性SIRT6敲除的小鼠最终小鼠发展为脂肪肝。
总之,本研究通过对高脂喂养及吡格列酮干预后大鼠各组织SIRT6表达水平的观察,发现高脂喂养降低SIRT6的表达,而吡格列酮治疗后可逆转SIRT6的表达,且血糖血脂明显改善,推测吡格列酮通过激动PPARγ上调 SIRT6的表达从而影响糖脂代谢,但PPARγ对SIRT6的具体调控机制还有待细胞水平的进一步分析。
1 Frye RA.Phylogenetic classification of prokaryotic and eukaryotic Sir2- like proteins[J].Biochem Biophys Res Commun,2000,273(2):793-798
2 Mostoslavsky R,Chua KF,Lombard DB,et al.Genomic instability and aging - like phenotype in the absence of mammalian SIRT6[J].Cell,2006,124(2):315-329
3 Zhong L,D'Urso A,Toiber D,et al.The histone deacetylase Sirt6 regulates glucose homeostasis via Hif1alpha[J].Cell,2010,140(2):280-293
4 Kim HS,Xiao C,Wang RH,et al.Hepatic- specific disruption of SIRT6 inmice results in fatty liver formation due to enhanced glycolysis and triglyceride synthesis[J].Cell Metab,2010,12(3):224 -236
5 Kanfi Y,Peshti V,Gil R,et al.SIRT6 protects against pathological damage caused by diet- induced obesity[J].Aging Cell,2010,9(2):162-173
6 Palmer NO,Fullston T,Mitchell M,et al.SIRT6 inmouse spermatogenesis ismodulated by diet- induced obesity[J].Reprod Fertil Dev,2011,23(7):929-939
7 Yang SJ,Choi JM,Chae SW,etal.Activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma by rosiglitazone increases sirt6 expression and ameliorates hepatic steatosis in rats[J].PLoSOne,2011,6(2):e17057