调免毓麟汤对免疫性不育大鼠精液酸性磷酸酶、抗精子抗体及合笼后雌鼠妊娠率的影响

舒劲松，曹继刚，周安方，黄琼霞，董德河

（湖北中医药大学 基础医学院，湖北 武汉 430065）

免疫性不育的临床诊断主要以血清或（和）精浆中发现抗精子抗体（AsAb）为依据，多伴有腰膝酸软、耳鸣等症状或有生殖道感染、性腺损伤、输精管堵塞等病史［1］。存在于正常人精浆中的精浆免疫抑制物（seminal plasma immunoinhibition material，SPIM）能遮蔽和改变精子抗原，抑制局部和全身的细胞、体液免疫反应，维护正常的生殖生理过程。有研究表明，人精液酸性磷酸酶（ACP）是人精液中的免疫抑制物的主要成分之一，其减少时可能会引起AsAb的产生。根据《实用男科疾病诊断治疗学》［2］及《临床疾病诊断依据治愈好转标准》［3］制定的免疫性不育治疗效果标准——AsAb转阴是治疗免疫性不育的一项重要指标。本实验通过检测大鼠精液ACP活性，观察调免毓麟汤对模型大鼠的AsAb转阴率以及与配对雌鼠合笼后的胚胎数和妊娠率等指标，探讨调免毓磷汤抑制AsAb的产生及生殖系统免疫反应的作用机理。

1 材料与方法

1.1 动物

3月龄SD雄性大鼠120只，雌性70只，体重（280±20）g。购自华中科技大学同济医学院实验动物中心。

1.2 药物

调免毓麟汤（熟地、巴戟天、蒲公英、败酱草、丹参、川牛膝、甘草等组成），由湖北中医药大学附属门诊部制成水煎剂，临用时用蒸馏水配成低、中、高三种不同的浓度，即1.04、2.08、4.16g／mL；醋酸强的松片，江西国药厂生产，批号：0604041，临用时研末用蒸馏水配成0.0324g／mL的混悬液。

1.3 试剂与仪器

酸性磷酸酶（ACP）试剂盒，由南京建成生物工程研究所提供。其组成为：缓冲液、基质液、碱液、显色剂、酶标准贮备液，临用时酶标准贮备液按1：10与蒸馏水配制成0.1 mg／mL的酶标准应用液。抗精子抗体酶联免疫测定（ELISA）试剂盒，由华美生物工程公司提供。试剂盒内组分有：预包被板，样品反应液，阴性对照液，阳性对照液，清洗液，酶结合物，显色液A，显色液B，终止液。

1.4 造模与给药

参照张淑芹等［1］方法，将60只雄性大鼠采用同种异体抗原进行主动免疫，复制免疫性不育大鼠模型。第3次加强免疫后共有57只大鼠血清AsAb为阳性，2只大鼠血清AsAb为阴性，1只死亡。

大鼠造模前随机取10只作为正常对照组，并将57只AsAb阳性雄性大鼠按随机数字表法随机分为模型组11只、醋酸强的松组11只、调免毓麟汤低剂量组11只、调免毓麟汤中剂量组12只、调免毓麟汤高剂量组12只。正常组及模型组灌胃生理盐水，其余各组灌胃相应药2mL／只，每日1次，连续30天。

1.5 取材与制备

各组雄鼠在灌胃给药第30天，按照文献［4］进行大鼠采精实验。抗原的制备：每次免疫前取3月龄雄性SD大鼠12只，急性断头处死后取双侧附睾，用生理盐水冲洗，置于10mLM199获能液中，剪碎，37℃静置15min，尼龙网（孔径200μm）过滤，37℃培育1.5h，加PBS溶液调精子数为2.8×106／mL，加入完全福氏佐剂10mL，研磨混匀作为抗原。又分别于灌胃给药第10天、第20天、第30天断尾取血10μL，分离血清，用酶联免疫吸附法（ELISA法）检测血清AsAb；停药后，各组雄鼠与雌鼠合笼1周，每只雄鼠与1只雌鼠配对，从合笼次日起每天上午9：00-10：30作阴道涂片。

1.6 统计学处理

2 实验结果

2.1 调免毓麟汤对免疫性不育大鼠精液ACP活性的影响

实验结果表明，模型组大鼠精液ACP活性显著下降，与正常组比较有极显著性差异（P＜0.01）；各治疗组大鼠精液ACP活性较之模型组有所上升，醋酸强的松组大鼠精液ACP活性与调免毓麟汤低剂量组比较差异不显著（P＞0.05），与调免毓麟汤中、高剂量组比较有极显著性差异（P＜0.01）；调免毓麟汤中、高剂量组间比较差异不显著（P＞0.05）。见表1。

表1 调免毓麟汤对免疫性不育大鼠精液ACP活性的影响（）

表1 调免毓麟汤对免疫性不育大鼠精液ACP活性的影响（）

注：与正常组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型组比较，★P＜0.05，★★P＜0.01；与醋酸强的松组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与调免毓麟汤低剂量组比较，◇P＜0.05，◇◇P＜0.01。

组别 n ACP（U／mL）10 63.93±14.89模型组 11 39.09±8.96△△醋酸强的松组 11 48.90±10.05△△★调免毓麟汤低剂量组 11 48.16±10.36△△★调免毓麟汤中剂量组 12 56.07±10.48★★▲▲◇调免毓麟汤高剂量组 12 57.48±10.56正常组★★▲▲◇

2.2 调免毓麟汤对免疫性不育大鼠血清AsAb的影响

实验结果显示，治疗第10天，各治疗组转阴率比较差异不显著（P＞0.05）；治疗第20天，各治疗组转阴率比较差异不显著（P＞0.05）；治疗第30天，调免毓麟汤各剂量组与醋酸强的松组比较有显著性差异（P＜0.05），调免毓麟汤各剂量组之间比较差异不显著（P＞0.05）。见表2。

表2 调免毓麟汤对免疫性不育大鼠血清AsAb的影响 ［n（%）］

2.3 调免毓麟汤对免疫性不育大鼠合笼后雌鼠妊娠率的影响

实验结果表明，模型组配对雌鼠有2只妊娠，其中有1只雌鼠在妊娠第11天流产；调免毓麟汤各剂量组妊娠率、每胎胚胎数均高于醋酸强的松组和模型组，调免毓麟汤各剂量组与模型组、醋酸强的松组比较有显著性差异（P＜0.01）；醋酸强的松组与模型组比较差异不显著（P＞0.05）。提示调免毓麟汤能显著提高雌鼠妊娠率、每胎胚胎数。此外，还观察到醋酸强的松组雄鼠毛欠光泽，不柔顺，饮食减少，体重下降，可能是醋酸强的松的副作用所致。由此推测，醋酸强的松的副作用可能是影响雌鼠妊娠率、每胎胚胎数的原因之一。见表3。

表3 调免毓麟汤对免疫性不育大鼠合笼后雌鼠妊娠率的影响（）

表3 调免毓麟汤对免疫性不育大鼠合笼后雌鼠妊娠率的影响（）

注：与正常组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型组比较，★P＜0.05，★★P＜0.01；与醋酸强的松组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与调免毓麟汤低剂量组比较，◇P＜0.05，◇◇P＜0.01。

10 10 100.0 131 13.1±1.5模型组 11 2 18.2△△ 8 4.0±1.4△△醋酸强的松组 11 4 36.4△△ 18 4.6±2.3△△调免毓麟汤低剂量组 11 9 81.8★★▲▲ 108 12.0±2.0★★▲▲调免毓麟汤中剂量组 12 11 91.7★★▲▲ 129 11.7±3.4★★▲▲调免毓麟汤高剂量组 12 11 91.7★★▲▲ 133 12.1±1.7总胚胎数 每胎胚胎数正常组组别 n 妊娠雌鼠数 妊娠率（%）★★▲▲

3 讨论

SPIM是存在于精液中的一组物质，通过封闭精子膜特异性抗原位点，或者通过对各种免疫细胞的抑制作用，使精子免受免疫细胞的进攻，从而保护精子，使得自身不产生免疫反应；ACP是人精液中的免疫抑制物的主要成分之一，其减少时可能会引起AsAb的产生。AsAb对精子膜固有成分及膜表面被覆成分的结合，不仅可以干扰精子的代谢及获能过程，影响精子的存活，导致精子凝集，活力下降；而且表面带有AsAb的精子，难以穿透宫颈粘液，从而降低受精部位的精子数；此外，AsAb还可干扰受精过程，甚至影响受精卵的分裂和植入以及胚胎的存活，导致流产和不育。本实验中模型组配对雌鼠只有2只妊娠，其中1只雌鼠在妊娠第11天流产，说明AsAb可通过不同的环节和机制影响精子的功能，干扰受精过程，而致流产和不育。

由于肾上腺皮质激素既有抗炎作用，又可影响抗原的合成，抑制AsAb和补体介导的精子细胞毒性，因而被西医用作治疗男性免疫性不育的常用药物，但长期或大剂量使用副作用大［5］。调免毓麟汤治疗作用在于扶正祛邪，扶正是调整机体的免疫功能，祛邪则是排除破坏免疫平衡的因素，从而达到新的平衡，同时调节全身免疫系统来消除As-Ab，使免疫功能恢复正常，且未见副作用。本实验中模型组大鼠精液ACP活性明显下降，很可能是精液参数各项指标下降，诱导AsAb产生，导致不育的重要原因。醋酸强的松组大鼠出现的毛欠光泽、不柔顺、饮食减少、体重下降等情况，可能是醋酸强的松的副作用所致。治疗第30天，调免毓麟汤各剂量组AsAb转阴率显著高于醋酸强的松组；调免毓麟汤各剂量组妊娠率和每胎胚胎数均高于模型组和醋酸强的松组。由此可知，调免毓麟汤对免疫性不育的治疗作用可能是通过提高精液ACP活性，从而抑制AsAb的产生，提高生育力。

［1］陈如钩.不孕不育治疗学［M］.上海：上海科学技术出版社，1997：144.

［2］郭瑞林.实用男科疾病诊断治疗学［M］.北京：人民军医出版社，1994：74.

［3］孙传兴.临床疾病诊断依据治愈好转标准［M］.北京：人民军医出版社，1999：464

［4］郑新民，李聚学，魏雁，等.小鼠采精方法的研究［J］.中国比较医学杂志，2005，15（2）：88-91.

［5］黄宇锋，许瑞吉.男科诊断学［M］.上海：第二军医大学出版社，1999：85-86.