芹菜素的抗炎作用及其机制

阚伟娟，喻婉莹，于鹏霞，李敏敏，宋吉帅，赵 烽＊

（1.烟台大学 药学院，山东 烟台 264005；2.烟台赛尔斯生物技术有限公司，山东 烟台 264006）

芹菜素，化学结构为5，7，4’-三羟基黄酮（见图1），是芹菜中的主要生物活性成分，有“植物雌激素”之称，广泛存在于多种水果和蔬菜中，车前子、络石藤、藿香等药材中含有大量的芹菜素。研究表明，其具有抗氧化、清除自由基［1］、抗肿瘤、抗炎［2］等作用。鄂裘恺［3］以小鼠为实验对象，灌胃法芹菜素给药。阿司匹林为阳性对照药，以醋酸所致扭体反应为疼痛指标，以二甲苯所致小鼠耳廓肿胀为炎症指标。结果发现：芹菜素高低剂量组均有镇痛作用，芹菜素高剂量组与阿司匹林组相当。各剂量组均有明显的消炎作用，芹菜素高剂量优于阿司匹林。以上结果提示芹菜素具有良好的镇痛消炎临床应用价值。然而，芹菜素药理学作用的研究大多尚处于动物模型阶段，作用机制仍不清楚。本研究利用LPS诱导体外炎症模型，检测芹菜素对LPS诱导巨噬细胞RAW 264.74释放炎症介质TNF-α、IL-6及NO的抑制作用，以及对iNOS、COX-2蛋白表达水平的影响，旨在探讨芹菜素抗炎的分子机制。

图1 芹菜素（Apigenin）结构

1 材料与方法

1.1 材料

芹菜素（HPLC≥98%）由烟台赛尔斯生物技术有限公司提供，以DMSO溶解、-20℃保存，使用前稀释至指定浓度。RPMI 1640、胎牛血清购自Hyclone公司；LPS（Escherichia coli 0111：B4）、MTT购自Sigma公司；青霉素-链霉素双抗溶液、0.25%胰酶消化液、小鼠TNF-αELISA试剂盒、小鼠IL-6ELISA试剂盒、一氧化氮检测试剂盒为烟台赛尔斯生物技术有限公司产品；Colorimetric COX Inhibitor Screening Assay Kit（760111），anti-murine iNOS polyclonal antibody，COX-2 （murine）polyclonal antibody购自 Cayman公司；β-actin antibody购自Santa Cruz Biotechnology，Inc。

1.2 细胞培养及传代

小鼠单核巨噬细胞株RAW 264.7购自中科院上海细胞库（ATCC TIB-71）；用含10%胎牛血清、100μg·mL-1链霉素，100U·mL-1青霉素的RPMI 1640培养液于37℃CO2培养箱中常规培养，隔天传代，细胞于对数生长期呈半贴壁状态生长。

1.3 NO浓度测定

按照文献中所述的方法进行测定［4］。

1.4 细胞体外生长活性检测

采用MTT法检测细胞体外生长活性。吸取培养液上清100μL测定NO的浓度后，于上述96孔板内每孔加入4μL MTT（终浓度200μg·mL-1），继续培养4h后弃去上清，吸干残留液，每孔加入DMSO 100μL，振摇至生成的蓝紫色甲瓒结晶完全溶解后，以630nm为参比波长，用酶标仪测定570nm处的吸光值（A570）。细胞生长抑制率（%）＝100×（1-实验组平均A570值／空白对照组平均A570值）。

1.5 ELISA法测定TNF-α、IL-6水平

取对数生长期的RAW 264.7细胞，用胰酶消化，制成每毫升含5×105个细胞的单细胞悬液，接种于96孔细胞培养板（每孔200μL），每组设3个平行孔。培养1h后分别加入不同浓度的芹菜素及LPS（终浓度1μg·mL-1），同时设LPS组和空白对照组，置37℃培养箱中培养6h后收集细胞上清液，按照相应的ELISA试剂盒说明书方法进行测定，根据标准曲线计算各组培养上清中TNF-α、IL-6的浓度［5］。

1.6 比色法测定COX-2酶活性

每个样品设两个平行孔，按照说明书方法进行测定。

1.7 Western Blotting法检测iNOS、COX-2及内参蛋白β-actin表达水平

取RAW 264.7细胞接种于60mm培养皿，37℃培养1h后给药，同时设空白组、LPS组。培养24h后，收集细胞，超声破碎提取总蛋白，采用Bradford法进行定量。取30μg总蛋白行12%SDS-PAGE电泳后，转膜，5%脱脂奶粉4℃封闭过夜，T-TBS洗膜3次，加入一抗溶液4℃孵育2h，用相同方法洗膜，加入HRP标记的二抗溶液4℃孵育1h，相同方法洗膜后加入ECL发光剂，放入暗盒中压片、显影、定影。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 芹菜素对LPS诱导RAW 264.7细胞释放NO的抑

空白组细胞上清中检测到的NO浓度非常低，仅为0.47μmol·L-1，在1μg·mL-1的LPS刺激下，巨噬细胞释放出大量的NO（12.39μmol·L-1），经3～4次重复实验表明两组间有显著性差异，P＜0.01，表明LPS能明显诱导RAW 264.7细胞释放大量炎性介质NO。与LPS组相比，经芹菜素作用的RAW 264.7细胞上清液中，NO的含量明显减少，随着用药浓度的增高NO的浓度逐渐降低，呈现出良好的剂量依赖关系。50～100μmol·L-1芹菜素能够完全抑制LPS诱导的NO释放，25μmol·L-1芹菜素能够显著抑制LPS诱导的NO释放，作用强度与100μmol·L-1抗炎药物氢化可的松相当，结果见图2。

2.2 芹菜素对RAW 264.7细胞增殖无显著影响

芹菜素在12.5～100μmol·L-1浓度范围内，对RAW 264.7细胞的正常增殖均无明显抑制作用，高浓度下（100μmol·L-1）作用24h后，给药组细胞的存活率为99.80%，无细胞毒性。

2.3 芹菜素对LPS诱导RAW 264.7细胞释放IL-6水平的影响

如表1所示，空白对照组细胞上清液中IL-6的浓度为190.15pg·mL-1，经过1μg·mL-1的LPS刺激6h后，细胞释放大量的IL-6，此时上清液中IL-6的浓度为1526.62 pg·mL-1，与空白组比较有显著性差异，P＜0.05。不同浓度的芹菜素可以极为显著地抑制LPS诱导RAW 264.7细胞释放IL-6，P＜0.05。

图2 芹菜素对LPS诱导RAW 264.7细胞释放NO的抑制作用

表1 芹菜素对LPS诱导RAW 264.7细胞释放IL-6的抑制作用

2.4 芹菜素对LPS诱导RAW 264.7细胞释放TNF-α的影响

如表2所示，空白对照组细胞上清液中TNF-α的浓度为7.23pg·mL-1，经过1μg·mL-1的LPS刺激6h后，细胞释放大量的 TNF-α，此时上清液中 TNF-α的浓度为4943.85pg·mL-1，与空白组比较有显著性差异，P＜0.01。12.5～100μmol·L-1的芹菜素可以显著抑制LPS诱导RAW 264.7细胞释放TNF-α，作用强度优于阳性对照药物氢化可的松。

表2 芹菜素对LPS诱导RAW 264.7细胞释放TNF-α的抑制作用

2.5 芹菜素对COX-2酶活力的影响

以纯化的COX-2酶活力值为100，芹菜素在0.125～1mmol·L-1浓度范围内对COX-2酶活力无明显抑制作用。而阳性对照药物1mmol·L-1氢化可的松可使COX-2酶活力明显降低，P＜0.01，结果见图3。

图3 芹菜素对COX-2酶活力的影响

2.6 芹菜素对iNOS、COX-2蛋白表达的抑制作用

如图4所示，以 Western blot法检测iNOS、COX-2及内参蛋白β-actin的水平，结果表明正常细胞中几乎不表达iNOS和COX-2蛋白，经过1μg·mL-1的LPS刺激24h后，iNOS和COX-2的蛋白水平显著升高。高浓度芹菜素可以轻微抑制LPS诱导的iNOS蛋白表达升高，但是对COX-2蛋白水平升高无明显抑制作用。

图4 芹菜素对LPS诱导iNOS和COX-2蛋白表达升高的抑制作用

3 讨论

芹菜素及其制剂作为抗炎中药制剂，在临床上得以广泛应用，但其作用机理尚未充分阐明。本研究针对芹菜素对LPS诱导小鼠巨噬细胞释放NO、IL-6及TNF-α等炎症因子的抑制作用进行了研究，结果表明芹菜素能显著抑制LPS诱导RAW 264.7细胞分泌NO、IL-6和TNF-α等炎性因子，并且对iNOS蛋白表达也有抑制作用。由此可以明确芹菜素是通过下调iNOS蛋白表达，抑制巨噬细胞产生NO、IL-6和TNF-α等炎性细胞因子从而发挥抗炎作用。

［1］文赤夫，董爱文，罗庆华，等.紫花地丁中芹菜素提取和清除自由基活性研究［J］.现代食品科技，2006，22（1）：20-25.

［2］隋海霞，徐海滨，荫士安.芹菜素的生物学作用［J］.国外医学·卫生学分册，2008，35（2）：103-107.

［3］鄂裘恺，谢焕松，周鸣鸣.芹菜素镇痛消炎作用研究［J］.辽宁中医药大学学报，2008，10（7）：145-146.

［4］赵凯华，赵烽，刘珂.腺梗豨莶提取物对脂多糖活化巨噬细胞释放一氧化氮的抑制作用［J］.烟台大学学报：自然科学与工程版，2009，22（2）：137-140.

［5］ZHAO F，XU H，WANG L，JIANG YT，Liu K.Inhibitory effects of sesquiterpenes from Saussurea lappa on the overproduction of nitric oxide and TNF-αrelease in LPS-activated macrophages［J］.Asian Nat Prod Res，2008，10（11）：1045-1053.