FAT对K562和K562／A02细胞内药物积聚浓度的影响

张玉霞，梁 琼

（1.海南工商职业学院 应用技术系，海南 海口 570203；2.海口经济学院 工程技术学院，海南 海口 570203）

阿霉素、柔红霉素是治疗急性白血病的常用化疗药物，是通过抑制细胞内DNA的合成而发挥作用，监测白血病细胞内的阿霉素或柔红霉素浓度对临床疗效的预测有很大意义；同时阿霉素、柔红霉素化疗常导致白血病细胞的获得性耐药——多药耐药，耐药的白血病细胞常使细胞内药物的排出增加，使细胞内药物浓度降低，导致化疗失败，所以抗癌药物的浓度测定是多药耐药研究的重要课题［1］。用罗丹明123（Rhodamine 123）荧光染料作为被测抗癌药物的代表在细胞中的积累，因为罗丹明123的结构与阿霉素、柔红霉素等众多蒽环类抗癌药物的结构有许多相同之处（如有芳香杂环、有疏水性、有氮残基等）。它能有效地被P-170糖蛋白排出细胞外，并且有强荧光性，容易测定，而且即使浓度很高也不致杀死细胞［2］。福安泰（FAT）是本实验室首次从我国南海海域生长的一种生物组织中分离出来的抗癌活性成分，其生物活性强。本研究采用流式细胞术对K562和K562／A02细胞内罗丹明123积聚浓度的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系

K562细胞由中国科学院上海细胞生物学研究所提供，K562／A02细胞由中国医学科学院天津血液研究所提供。

1.1.2 试剂和药物

RPMI-1640粉（美国HyClone公司）；小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司产品）；ADM（美国Alexis产品）；罗丹明123（美国Alexis产品）。

1.1.3 主要仪器

TC2323CO2培养箱（美国Shellab公司）；UV-1601紫外分光光度仪（日本Shimadzu公司）；JY92-Ⅱ型超声波细胞粉碎机（宁波新芝科器研究所）；1-13微型高速离心机（美国Sigma公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

参照鄂征［2］的培养方法，K562细胞接种于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液，置37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中培养，2天换液1次。K562／A02细胞接种于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液，诱导药物阿霉素的浓度从低（0.6μg／mL）到高（可达到2μg／mL），最后在培养体系中加入终浓度为1μg／mL的阿霉素长期传代培养，以维持耐药性，培养条件同K562细胞，实验前无药培养2周。

1.2.2 FAT的定量

取适量FAT样品，经三蒸水稀释后至100μL，加入C液500μL使其反应10min左右，再加入D液50μL，使作用30min左右，用紫外分光光度计测量，使其OD值在0.2～0.8范围内，同时作标准曲线，标准蛋白采用牛血清白蛋白。

1.3 流式细胞仪测定K562细胞和K562／A02细胞内罗丹明123含量［3］

参照Bin等［3］取细胞形态良好、对数生长期的K562细胞和K562／A02细胞分别离心（600rpm／min；5min），吸去上清，用含10%小牛血清的RPMI 1640培养基调整细胞数为6.25×105个／mL，将细胞悬液接种于24孔培养板，800μL（5×105个细胞）／孔，两种细胞各分5组：K562细胞；K+VRP10μmol／L；K+FAT 0.02mg／mL；K+FAT 0.04mg／mL；K+FAT 0.08mg／mL；K562／A02细胞；K／A+VRP10μmol／L；K／A+FAT 0.02mg／mL；K／A+FAT 0.04mg／mL；K／A+FAT 0.08mg／mL，每组3个平行孔，按实验分组分别加入相应浓度的药物工作液100μL，同时加入罗丹明123100μL，终浓度为5μg／mL，终体积为1mL，混匀后置37℃，5%CO2饱和湿度条件下培养1h，加入冷PBS 2mL终止细胞代谢，收集细胞到离心管中，离心（1500 rpm／min；2min），弃上清，冷PBS洗两次，再加1mL PBS制成细胞悬液，采用美国Coulter公司生产的EPICS XL型流式细胞仪，以氩离子激光器为激发光源，激发波长为488nm，最大发射波长575nm，测定数据输入计算机，用Multicycle软件分析细胞罗丹明123含量。

1.4 统计学方法

实验数据用表示。并用组间t-检验分析差异的显著性。

2 结果

流式细胞术检测结果显示，罗丹明123作用1h后，K562细胞内含量 （92.4%）明显高于 K562／A02细胞（0.02%）；VRP（10μmol／L）、FAT （0.02、0.04、0.08mg／mL）作用1h后，K562／A02细胞内罗丹明123含量从0.02%分别增加到10.7%、18.3%、38.3%、50.4%，可见，FAT可增加K562／A02细胞内的药物含量，与剂量相关；但FAT对K562细胞内罗丹明123含量没有显著影响，见图1、图2、图3。

图1 流式细胞术分析FAT处理K562细胞后罗丹明123含量

3 讨论

流式细胞术是近年发展起来的一种快速对单细胞进行定量分析和分选的新技术。流式细胞仪可以准确定量、随机摄取大量细胞群，通过数据处理，十分明显地显示出细胞内药物荧光含量。选用罗丹明123摄入量作为细胞耐药性的标志，用流式细胞仪可以很容易地将细胞按荧光强度分开；敏感细胞由于没有或很少P-170糖蛋白，不能将进入细胞中的罗丹明123排出，在细胞中遂积累大量罗丹明123，荧光强度很大。而耐药细胞有P-170糖蛋白的过表达，使进入细胞的罗丹明123可以有效地被泵出细胞，细胞内的罗丹明123少，荧光强度非常低。采用流式细胞术测定K562及K562／A02细胞内罗丹明123含量也证实，在药物作用1h后K562细胞内罗丹明123含量均高于K562／A02细胞；各药物处理组K562／A02细胞内罗丹明123含量均高于未经药物处理的K562／A02细胞，但低于K562细胞；FAT对K562／A02细胞内罗丹明123含量呈剂量相关。而对于K562内罗丹明123含量，FAT没有显著影响。上述研究说明，FAT可以增加药物在K562／A02细胞内的积聚浓度，逆转K562／A02细胞的 MDR，随着剂量增加，逆转作用也增加。考虑FAT逆转MDR的机理还有待于进一步深入的研究。本研究为增加白血病及其他肿瘤的化疗疗效提供了有力的实验依据。

图2 流式细胞术分析FAT处理K562／A02细胞后罗丹明123含量

图3 FAT对K562和K562／A02细胞内罗丹明123含量的影响

［1］马建国，杨纯正，李中，等.白血病细胞内柔红霉素的测定［J］.药物分析杂志，1992，12（1）：9-11.

［2］鄂征.组织培养和分子细胞学技术［M］.北京：北京出版社，1994：133-134.

［3］BIN LIU M D，EDGAR D STAREN M D，PH D，et al.Mechanisms of Taxotere-Related Drug Resistance in Pancreatic Carcinoma［J］.Journal of Surgical Research，1999：179-186.

［4］何一心，杨少光，张淑靖，等.多药耐药性细胞的鉴别和分离［J］.中华血液学杂志，1992，13（4）：173-175.