大孔吸附树脂分离纯化齿叶白鹃梅叶中的总黄酮

王灵芝，刘玉强，才 谦

（辽宁中医药大学，辽宁 大连 116600）

齿叶白鹃梅（Exochorda serratifolia S.Moore.）是蔷薇科绣线菊亚科白鹃梅属植物［1］。白鹃梅属分为白鹃梅和齿叶白鹃梅两个种，其中白鹃梅主要生长在我国的江苏、浙江、安徽一带，以其根皮、树皮入药，用于腰膝酸痛的治疗［2］；齿叶白鹃梅主要生长在辽宁凌源、喀左等地区及河北一带，其花蕾和幼叶可食用，并且作为民间偏方来预防和治疗糖尿病。本课题组从齿叶白鹃梅叶中分离得到多个黄酮化合物［3］，为进一步研究，对总黄酮进行富集。本文采用静态吸附法及吸附动力学试验对7种大孔吸附树脂进行筛选，并优选纯化工艺。

1 仪器与试药

1.1 仪器

UV-3010型紫外分光光度计（日本岛津）；AR2140电子分析天平（上海奥豪斯公司）；sartorius CP225D型电子天平（十万分之一，德国sartorius公司）；恒温水浴锅（巩义市英峪予华仪器厂）；DFT型药用万能粉碎机（温岭市大得中药机械有限公司生产）。

1.2 试药

乙醇（分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司）；大孔树脂 HPD600，HPD100，DM130，HPD826，AB-8，D101，HPD400（沧州宝恩大孔树脂有限公司）。实验用齿叶白鹃梅叶：采于辽宁省朝阳市凌源县，由辽宁中医药大学王冰教授鉴定为齿叶白鹃梅（Exochorda serratifolia S.Moore.）叶；芦丁对照品（自制，纯度为98%以上）。

2 方法与结果

2.1 树脂型号的考查

2.1.1 树脂的预处理

无水乙醇充分浸泡24h后用乙醇洗至洗出液加适量水时无白色混浊现象，然后用去离子水洗尽醇，再用5%的盐酸浸泡3h后用去离子水洗至中性后5%氢化钠溶液浸泡3h，同样洗至中性，滤去水溶液，烘干备用。

2.1.2 树脂静态吸附筛选实验

（1）静态吸附量及吸附率的测定。

将7种不同型号的树脂分别按上述方法预处理，各取3g精密称定，分别置于带磨口塞的三角瓶中，精密加入齿叶白鹃梅叶的提取液15mL（总黄酮浓度为2.7mg·mL-1），充分振摇，静置24h后，抽滤，测定滤液中总黄酮浓度。计算各树脂室温下的吸附量及吸附率：

其中：E为吸附率，C0起始浓度（mg·mL-1），Cr为滤液浓度（mg·mL-1），Q 为吸附量（mg·g-1），V 为溶液体积（mL），W 为树脂重量（g）。

（2）静态解吸率的测定。

收集（1）中滤出滤液的饱和树脂，精密加入95%乙醇20mL进行解吸，充分振摇，静置24h，滤过得解吸液，测定总黄酮浓度。计算解吸率（%）：

解吸率（%）＝（解吸液浓度×解吸液体积）／树脂的饱和吸附量×100%

结果见表1。

根据上述吸附率和解析率结果可以看出D101树脂对齿叶白鹃梅叶总黄酮的吸附量和解吸率适中。因此，选择D101树脂进行总黄酮的富集纯化。

表1 7种树脂对齿叶白鹃梅叶总黄酮的静态吸附-解吸附考察结果 （n＝3）

2.2 D101型大孔吸附树脂纯化齿叶白鹃梅叶总黄酮的工艺参数优选

2.2.1 最佳上样浓度的确定

将不同浓度的齿叶白鹃梅叶样品溶液（总黄酮的上样量一致），分别通过装有相同量D101型大孔树脂的层析柱（1BV＝20mL）进行动态吸附［4］。考察树脂对不同浓度上样液中总黄酮吸附差别。待吸附完全后以3BV水洗脱，3.5 BV 95%乙醇解吸，收集解吸液，测定总黄酮回收率，确定最佳上样浓度。从结果可知，大孔树脂对齿叶白鹃梅叶总黄酮的吸附随浓度的变化而变化，齿叶白鹃梅叶总黄酮的回收率在上样浓度为2mg·mL-1时最高。因此，确定齿叶白鹃梅叶提取物上样液总黄酮的浓度为2.0mg·mL-1＼。

2.2.2 泄漏曲线的绘制

将不同体积总黄酮的浓度为2.0mg·mL-1的齿叶白鹃梅叶样品液通过D101大孔树脂的玻璃柱（1BV＝20mL）进行动态吸附，分部收集洗脱液，测定每份收集液总黄酮含量，计算未吸附率，为了总黄酮保留完全，设定未吸附率15%为泄漏点，从结果可知，上样量为30mL时，未吸附率开始明显增大，说明树脂柱此时不能完全吸附样品液中的总黄酮。据此确定30mL（1.5BV）作为最大上样量。

2.2.3 洗脱溶剂的筛选

按上述确定的吸附条件进行动态吸附后，用3BV水洗去未吸附成分后，分别用3.5BV的30%，50%，70%，90%的乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液，测定洗脱液中总黄酮的含量，计算总黄酮回收率。结果见表2。

表2 不同浓度乙醇洗脱剂洗脱结果 （n＝3）

由表2可知，90%乙醇洗脱的总黄酮的回收率最高，因此选择90%乙醇为齿叶白鹃梅叶总黄酮的洗脱剂。

2.2.4 洗脱曲线的绘制

按上述确定的吸附条件和洗脱条件，取齿叶白鹃梅叶样品液进行上柱、吸附和洗脱，分段收集洗脱液。每5mL收集1份，共收集27份，计算每份洗脱液中总黄酮浓度，从结果得知，当洗脱液用量为90mL（4.5BV）时，洗脱液中总黄酮含量几乎为零，说明树脂柱上吸附的总黄酮已基本洗脱完全。因此，洗脱剂用量为4.5倍树脂床体积。

2.3 D101大孔吸附树脂纯化齿叶白鹃梅叶总黄酮工艺的验证

取三批齿叶白鹃梅叶样品液各30mL分别按上述确定的吸附、洗脱条件进行上柱、吸附和洗脱，收集洗脱液，测定总黄酮含量，计算总黄酮回收率及纯度。结果见表3。

表3 D101树脂纯化齿叶白鹃梅叶总黄酮的工艺验证结果

由表3看出，经D101大孔树脂处理后的齿叶白鹃梅叶总黄酮回收率大于95%，平均纯度为59.44%，RSD＝1.91%，具有良好的重现性。

3 结论

通过静态吸附-解吸试验，从7种大孔吸附树脂中筛选出D101型大孔树脂最适合齿叶白鹃梅叶总黄酮的富集。通过动态吸附-洗脱试验，D101型大孔树脂富集齿叶白鹃梅叶总黄酮的工艺条件为：上样溶液中总黄酮的浓度以2.5 mg·mL-1为宜，最大上样量为1.5倍树脂床体积，洗脱溶剂为90%乙醇，洗脱剂用量为4.5倍树脂床体积，可得总黄酮质量分数为59.10%的齿叶白鹃梅叶提取物粉末。

［1］傅沛云.东北植物检索表［M］.北京：科学出版社，1995：283-284.

［2］中国药材公司.中国中药资源志要［M］.北京：科学出版社，1994：508.

［3］才谦，王聪，刘玉强.齿叶白鹃梅叶中黄酮类成分的分离与结构鉴定［J］.沈阳药科大学学报，2011，28（3）：190-191.

［4］才谦，刘涛，付玉芹，等.大孔吸附树脂法富集龙胆中裂环烯醚萜苷类成分的实验研究［J］.中成药，2003，25（4）：271-172.