性周期筛选合笼与非筛选合笼制备大鼠妊娠模型的比较

陈滢如，朱 江，苑鸿雯，舒福政，马良宵，任晓暄

（北京中医药大学推拿针灸学院，北京 100029）

随着医学的发展，实验研究在基础部门及临床科室中均得到了广泛的开展，孕鼠及胎鼠在生殖生物学及胚胎学相关实验研究中运用广泛。有研究者［1］曾对合笼后大鼠是否受孕所采用的托盘阴栓观察法和阴道涂片精子检查法进行了比较，但对大鼠合笼方法（筛选性周期合笼或自由合笼）未提及；何氏等［2］通过研究认为根据阴道图片判断各雌鼠所处的性周期阶段，安排处于动情前期或动情期的雌鼠进行交配与普通自由交配组比较能够有效提高整体受孕速度，但未对两种方法在雌鼠受孕率方面进行比较。笔者以晚孕大鼠为研究对象，需准确掌握大鼠的妊娠天数，同时以减少可能对大鼠造成影响的人为干预为重要关注内容，以尽可能的减少对大鼠的刺激和影响。虽然何氏等［2］的研究认为阴道涂片筛选性周期交配组在提高整体受孕方面优于普通自由交配组，但考虑到其未对受孕率进行比较，以及阴道涂片对于大鼠而言确实是一种较强烈的人为刺激，可能会对大鼠造成隐在未知的影响，因此我们从大鼠受孕率和受孕速度方面对制备大鼠妊娠模型的两种不同合笼方法进行了比较。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：选用成年SD大鼠，清洁级，性成熟未交配（大鼠性成熟6～8周，体成熟12～16周［3］），雌性26只，体重210～220g，周龄8周，雄性8只，体重240～300g，周龄8周，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供（编号：0024631）。饲养条件：室内温度20℃±1℃，湿度45％±5％，日光灯光照，普通清洁级鼠饲料自由采食饲养，自由饮用自来水。

1.1.2 器材：普通光学显微镜（日本OLMPUS），载玻片，0.9％生理盐水，医用棉签。

1.2 方法

1.2.1 雌性大鼠性周期各阶段判读标准［4］：（1）动情前期：持续时间17～21h，涂片可见大量有核上皮细胞、少量角化上皮细胞；（2）动情期：持续时间9～15h，涂片可见满视野角化上皮细胞、少量有核上皮细胞；（3）动情后期：持续时间10～14h，涂片可见角化上皮细胞及白细胞；（4）动情间期：持续时间60～70h，涂片可见大量白细胞及少量黏液。

1.2.2 阴道涂片：每天上午8：00开始，取待检查雌鼠，一手拇指和食指捏压住颈部，掌根部压于腰背部限制活动，另一手翻起尾巴露出阴道口，用沾有生理盐水的棉签在阴道口稍作停留以让雌鼠适应，

稍后轻轻插入大鼠阴道病缓慢转动半圈，抽出棉签并将棉签上的附着物均匀涂在载玻片上镜检（10×10倍）。

1.2.3 受孕判断：文献［1］在大鼠孕鼠模型的鉴定中对托盘阴栓检查法和阴道精子检查法进行过比较，认为托盘阴栓观察法完全可以替代阴道精子检查法并优于精子检查法。本实验在实验初期采用托盘阴栓观察法作为交配后雌鼠是否受孕的判断标准，以托盘中发现阴栓者判断为已交配，并记发现阴栓当日为受孕第1天；实验后期（妊娠第20天）采用解剖法判断雌鼠是否受孕。

1.2.4 实验分组：随机分为阴道涂片性周期筛选合笼交配组（简称涂片组）和普通自由合笼交配组（简称自由组）。涂片组，经阴道涂片筛选出处于动情期雌鼠，按体重排序，采用随机数字表［5］法进行随机分组，雌雄1：1［6］，于每日19：00～19：30随机合笼，于合笼后第1天（合笼当天记为第0天）、第2天、第3天8：00～8：30、12：00～12：30、19：00～19：30连续观察托盘，以发现阴栓者判断为已交配，并记当日为受孕第1天，另笼饲养；取出合笼第3天未发现阴栓雌鼠，重新涂片、排序、随机合笼；连续合笼3d记为合笼1次，连续3次合笼未孕雌鼠淘汰。

自由组，雌鼠按体重排序，采用随机数字表［5］法进行随机分组，雌雄1：1比例，于每日19：00～19：30随机合笼，于合笼后第1天（合笼当天记为第0天）、第2天、第3天8：00～8：30、12：00～12：30、19：00～19：30连续观察托盘，以发现阴栓者判断为已交配，并记当日为受孕第1天，另笼饲养；取出合笼第3天未发现阴栓雌鼠，重新排序再次随机合笼；连续3次合笼未孕雌鼠淘汰。

1.3 统计方法

实验数据用SAS软件包进行统计，差异显著性设为a=0.05。

2 结果

2.1 SD大鼠动情周期中各阶段阴道涂片观察

动情前期阴道涂片：大量不规则形有核上皮细胞，偶见少量角化上皮细胞（图1）；动情期阴道涂片：大量不规则形角化上皮细胞，多成堆积状互联成片（图2）；动情后期阴道涂片：不规则角化上皮细胞、有核上皮细胞和白细胞均可见（图3）；动情间期阴道涂片：大量白细胞、少量有核上皮细胞、偶见角化上皮细胞（图4）。

2.2 涂片过程观察

涂片前虽然对雌鼠背部进行抚摸安抚、将沾有生理盐水的棉签在阴道口稍作停留以让雌鼠适应，但从插入棉签过程中大鼠的抗拒或极力抗拒行为表现来看，阴道涂片方法对雌鼠而言是一种不舒适的、非良性的刺激。

2.3 两组雌鼠受孕率的比较

涂片组13只雌鼠第1次合笼有9只排栓，孕7只，假孕2只；1只未排栓，受孕；未见栓的3只雌鼠（不包括第1次合笼未见栓受孕雌鼠）继续第2次合笼，3只均见栓，均受孕；即涂片组13只雌鼠中，孕11只，其中10只见栓、1只未见栓；2只未孕，但均见栓（未孕的2只雌鼠均为第1次合笼时的见栓雌鼠）。自由组13只雌鼠第1次合笼有11只排栓，孕8只，假孕3只；未见栓的2只雌鼠第2次合笼，2只均见栓，均受孕；即自由组13只雌鼠中，孕10只，10只均见栓；3只未孕，但均见栓（未孕的3只雌鼠均为第1次合笼时的见栓雌鼠）。

在排栓与受孕方面，涂片组13只雌鼠，孕11只，其中10只排栓、1只未排栓；未孕2只，均排栓，为假孕。自由组13只雌鼠，孕10只，10只均排栓；未孕3只，均排栓，为假孕。两组见栓雌鼠数量与孕鼠数量均不一致，均为见栓雌鼠数量多于受孕雌鼠，且涂片组有1只雌鼠交配未排栓受孕，在第一次托盘检查时被当成未交配雌鼠继续合笼，在第2次合笼时发现阴栓，在分笼饲养后中途产仔8只，经计算生产日期与第1次合笼时受孕相符，26只雌鼠中只有此1例交配未排栓受孕雌鼠。

采用Fisher精确概率法对两种合笼方法的受孕率（涂片组84.6％，自由组76.9％）进行比较，两种合笼方法对受孕率差异不显著（P＞0.05）。

2.4 两组受孕速度的比较

实验以大鼠合笼次数（连续合笼3d记为合笼1次）及对应的受孕雌鼠数量为衡量大鼠受孕速度的指标，合笼次数与受孕速度成反比，实验中，两组雌鼠两次合笼受孕情况如前所述，涂片组13只雌鼠第1次合笼孕8只，自由组13只雌鼠第1次合笼孕8只。涂片组第2次合笼雌鼠3只，孕3只；自由组第2次合笼雌鼠2只，孕2只；由于两组第2次合笼的数据量无法满足统计要求，故只取第1次合笼的数据进行统计。

采用Fisher精确概率法对两种合笼方法的受孕速度进行比较，两种合笼方法对受孕速度差异不显著（P＞0.05）。

3 讨论

实验中涂片组受孕率84.6％，自由组76.9％，差异不显著（P＞0.05），即该实验中阴道涂片筛选性周期在雌鼠受孕率方面并无优势。阴道涂片对雌鼠而言是一种不良刺激，可能会导致雌鼠在随后的合笼过程中拒绝交配；实验中雌雄鼠连续合笼3d记为1次合笼，对自由组雌鼠而言雌雄鼠会同笼饲养3d，从动物饲养角度看雌雄同笼饲养时雄鼠会对雌鼠的动情周期产生影响，诱发雌鼠进入动情期进而交配，因此而影响涂片组筛选动情周期的优势得不到体现；实验样本量较少，因此也可能对涂片组与自由组在受孕率及受孕速度方面的比较产生影响。

实验中涂片组雌鼠、自由组雌鼠与雄鼠合笼后，雌鼠的排栓天数从1d到3d不等，涂片组平均2.2d，自由组平均2.3d，单纯从雌鼠排栓使用时间看两组有差异，该差异是否有意义，以及如果在实验中限定雌雄鼠合笼时间（天数），则涂片组在提高整体受孕率及速度方面是否有优势，均需要相关实验进一步验证。

实验中出现的假孕及交配未排栓现象，除了与动物个体差异有关，还与季节等因素有关，动物的繁殖高峰期在春季，本实验开展正是夏季初中期，虽然动物饲养在标准的实验室，但自然界季节变化的影响亦应被考虑。

在以孕鼠或胎鼠为研究对象的实验中，快速简便准确的制备孕鼠模型是保证实验顺利进行的首要因素。制备孕鼠模型考虑受孕率的同时，亦应对雌鼠的受孕速度予以考虑。

环境安静、外界少刺激是制备大鼠受孕模型过程中应当注意的重要因素［2］，结合实验涂片过程中雌鼠因阴道涂片刺激而引起的抗拒行为来分析，认为自由合笼交配法制备妊娠模型，可以最大程度减少人为干预对大鼠造成的刺激和影响，同时当动物数量比较多时，自由合笼交配法亦可以避免繁琐的涂片操作，减少实验人员的劳动量。

［1］李彦清，邵龙江，李森，等.大鼠阴栓的实验观察和孕鼠模型鉴定方法的比较［J］.中国实验动物学杂志，2002，12（1）：17-20.

［2］何秋明，肖尚杰，夏惠敏.大鼠阴道图片的观察［J］.广州医学院学报，2007，35（4）：54-56.

［3］军事医学科学院实验动物场.实验动物饲养与繁殖［M］.北京：科学出版社，1984：87-88.

［4］孙敬方.动物实验方法学［M］.北京：人民卫生出版社，2001：424-426.

［5］孙振球.医学统计学［M］.北京：人民卫生出版社，2002，540.

［6］闫晗，何桂林，张晓芳，等.如何提高实验动物的交配成功率［J］.毒理学杂志，2007，21（4）：318.