HPLC法测定莲房中槲皮素的含量

牛家丰，孔凡存

(1.枣庄市药品检验所，山东枣庄277102;2.枣庄市立二院，山东枣庄277103)

莲房为睡莲科植物莲(Nelumbo nucifera Gaertn.)的干燥花托。味苦、涩，温，归肝经，具有化瘀止血之功效。主要成分为金丝桃苷、槲皮素－3－二葡萄糖苷、槲皮素等黄酮类化合物［1］。《中国药典》［2］仅收载显微鉴别和理化鉴别项，无含量测定方法。本文首次采用HPLC法建立莲房中槲皮素的含量测定方法，为控制莲房药材的质量提供实验依据。

1 仪器与试药

Waters Alliance 2695高效液相色谱仪;Waters二极管阵列检测器(PDA 2996);Waters Empower色谱工作站;UV－2401PC紫外分光光度计(日本岛津);Sartorius电子天平。槲皮素对照品购自中国药品生物制品检定所(批号:100081－200504);甲醇为色谱纯;水为纯净水;其余所用试剂均为分析纯。莲房样品，经鉴定为睡莲科植物莲(Nelumbo nucifera Gaertn.)的干燥花托。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Phenomenex－C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相:甲醇 －0.2% 磷酸溶液(50∶50);检测波长:360 nm;PDA色谱峰光谱采集范围:300～400 nm;流速:1.0 mL·min－1;柱温:30 ℃;进样量:20 μL;理论塔板数按槲皮素峰计算应不低于2 500。

2.2 检测波长的选择 取槲皮素对照品适量，用甲醇溶解，照紫外—可见分光光度法，在200～400 nm之间扫描，槲皮素在360 nm处有最大吸收且峰形良好，故确定检测波长为360 nm。

2.3 供试品溶液色谱峰纯度检查 由于中药材无法制备阴性对照溶液，故选用二极管阵列检测器，在300～400 nm范围对供试品溶液色谱峰纯度进行检查。实验结果显示:供试品溶液与对照品溶液在槲皮素保留时间处的光谱图完全一致，表明供试品溶液在槲皮素保留时间处无其他干扰杂质。

2.4 线性关系考察 精密称取槲皮素对照品(五氧化二磷干燥器中减压干燥48 h)10.2 mg，用甲醇溶解并定容至100 mL，作为槲皮素对照品贮备液(浓度为0.102 mg·mL－1)。分别精密量取槲皮素对照品贮备液1、2、4、8、10 mL用甲醇溶解并定容至10 mL，作为5个浓度的槲皮素对照品溶液，分别精密吸取20 μL，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，以槲皮素进样量C为横坐标，吸收峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线，求得回归方程为 A=3 744 608C－34 106(r=0.999 7)。表明槲皮素在 0.204 ～2.040 μg 范围内，与吸收峰面积之间呈良好的线性关系。

2.5 精密度实验 取同一槲皮素对照品溶液(浓度为0.040 8 mg·mL－1)，在上述色谱条件下，连续进样 5次，测定，吸收峰面积分别为:3 054 041、3 033 706、3 053 315、3 046 547、3 020 652，平均值 3 041 652，RSD=0.47%。表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性实验 取同一供试品溶液，分别于制备0、1、2、4、6 h后测定，槲皮素吸收峰面积分别为:1 829 629、1 825 177、1 818 354、1 812 158、1 806 626，平均值1 818 389，RSD(%)=0.51。表明供试品溶液在制备后6 h内基本稳定。

2.7 重复性实验 取同一样品，平行制备5份供试品溶液，按上述色谱条件测定，计算含量，结果分别为0.041 9%，0.042 2%，0.041 5%，0.042 1%，0.041 7%，平 均 值0.041 9%，RSD(%)=0.68。表明方法的重现性良好。

2.8 加样回收率实验 精密称取已知含量(0.042 3%)的样品(水分5%)6份，分别精密加入一定量槲皮素对照品，按样品测定方法处理，测定，计算加样回收率，结果见表1。槲皮素的平均加样回收率99.44%，RSD=0.82%。表明测定方法准确、可靠。

表1 槲皮素含量测定加样回收率实验结果(n=6)

2.9 样品测定 取样品粉末(过三号筛)约2 g，精密称定，加入甲醇50 mL，回流提取2 h，提取液蒸干，残渣精密加入甲醇－25%盐酸溶液(4∶1)混合液50 mL，称定重量，加热回流30 min，放冷，用甲醇补足损失的重量，取续滤液用0.45 μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各20 μL，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，结果见图1，表2。

3 讨论与小结

3.1 预试证明 槲皮素在莲房中主要以苷的形式存在，因此需要水解后测定。实验过程中，我们从提取方法、提取溶媒、提取时间、水解时间几个方面对供试品溶液的制备方法进行了优化筛选。实验结果表明:回流提取的效率要高于超声提取;以甲醇为溶媒提取效果要优于乙醇;提取时间，我们比较了1 h、2 h、3 h，结果显示:2 h槲皮素溶出即达到平衡;水解时间我们比较了 15 min、30 min、45 min、60 min，结果显示:回流30 min即可以水解完全;故确定供试品溶液的制备方法为甲醇回流提取2 h，水解30 min。

图1 槲皮素含量测定高效液相色谱图

表2 莲房中槲皮素含量测定结果(n=3)

3.2 实验结果表明 不同产地的莲房样品中槲皮素含量有一定差异。其中浙江杭州产的莲房槲皮素含量最高，达0.084 4%，河北保定产的莲房槲皮素含量最低，为0.040 4%，前者高出后者一倍多;可见，产地对莲房药材中槲皮素的含量有一定的影响。

3.3 HPLC法测定莲房中槲皮素的含量，操作简便、准确，重现性好，加样回收率高，可以用于莲房的质量控制，填补《中国药典》莲房项下无含量测定的空白。

［1］南京中医药大学.中药大辞典(下册)［M］.上海:上海科学技术出版社，2006:2500.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版(一部)［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:257.