缺氧应激对HepG-2细胞AFP和ICAM-1表达的影响

卢根林，邓 勇，闫兴军

（1.义乌市中心医院，浙江 义乌322000；2.青海大学附属医院，青海 西宁810001）

缺氧应激对HepG-2细胞AFP和ICAM-1表达的影响

卢根林1，邓 勇2，闫兴军1

（1.义乌市中心医院，浙江 义乌322000；2.青海大学附属医院，青海 西宁810001）

目的：探讨缺氧应激对HepG-2细胞甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）和细胞间粘附分子（intercellular adhesion molecule，ICAM）-1表达的影响。方法：缺氧（5%O2、5%CO2、90%N2）和常氧培养 HepG-2细胞。细胞侵袭实验测定HepG-2细胞侵袭能力；四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法测定细胞增殖活性；逆转录聚合酶链反应技术测定常氧组和缺氧12、24h组 HepG-2细胞AFPmRNA和ICAM-1mRNA的表达量。流式细胞仪技术测定ICAM-1蛋白表达，放射免疫法测定HepG-2细胞培养上清AFP蛋白表达。结果随着缺氧时间的延长HepG-2细胞的侵袭能力、增殖活性、AFP、ICAM-1 mRNA和蛋白表达量明显增高（P＜0.01）。结论：缺氧应激下人HepG-2细胞侵袭能力增强的机制之一是ICAM-1基因表达上调；HepG-2细胞增殖活性增强的机制之一是HepG-2细胞AFP基因的表达上调。

缺氧应激；HepG-2细胞；甲胎蛋白；细胞间粘附分子-1

肿瘤侵袭、转移是多因素、多步骤的生物学过程，其发生有赖于肿瘤细胞运动侵袭能力增强、不同时相细胞粘附与解粘附、降解并穿过细胞外基质进入血液和淋巴循环［1］。实体瘤存在着缺氧的局部微环境，缺氧时肿瘤细胞增殖活性、侵袭和转移能力增强，糖酵解途径上调、对化疗药物耐药性增强，对放疗敏感下降［1］。本研究模拟肝癌缺氧微环境，探讨缺氧应激对人肝癌细胞HepG-2细胞侵袭能力和增殖活性和AFP、ICAM-1表达的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞株和主要试剂

人肝癌细胞株HepG-2引自兰州军区总医院实验科（来源于美国国立肿瘤研究所），胎牛血清为杭州四季青生物工程公司产品，MTT、DMSO和胰蛋白酶均为美国Sigma产品，RT-PCR Kit购于Takara公司，Trizol为Invitrogen公司产品。人β-肌动蛋白（β-actin）、AFP和ICAM-1基因聚合酶链反应引物序列如下：β-actin上游引物 5′-GTACCACTGGCATCGTGATGGACT-3′，下游引物 5′-ATCCACACGGAGTACTTGCGCTCA-3′，目的片段长 度 为600bp；AFP 上游引物 5′-GTTCCAGAACCTGTCACAAG-3′，下 引 物 5′-CTTTGTTTGGAAGCATTCAACTGC-3′，目的片段长度为 193bp；ICAM-1 上游引物 5′-TGGTAGCAGCCGCAGTCATA-3′，下引物 5′-CTCCTTCCTGGCTTAGT-3′，目的片段长度为377bp；由Invitrogen公司合成。兔抗人 ICAM-1多克隆抗体，羊抗兔IgG-FITC荧光标记二抗均购自武汉博士德公司，AFP试剂盒由上海生物制品研究所提供。

1.2 体外细胞培养及实验分组

人HepG-2细胞置灭活10%胎牛血清、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640培养液，于37℃、5%CO2培养箱中培养，每3-5天传代一次。缺氧12、24小时组 HepG-2细胞置37℃、5%O2、5%CO2、90%N2三气培养箱中分别培养 12、24h。

1.3 HepG-2细胞增殖活性检测［2］

用四甲基偶唑蓝（MTT）比色法检测细胞增殖活性的变化，设置无细胞孔做空白对照，置Bio-Tek酶标仪上选择490nm波长读吸光度（A），各孔的A值=各孔所测A值-空白对照孔所测A值。

1.4 细胞侵袭实验［3］

Matrigel（30μg/孔）铺于Transwell小室8μm聚碳酸酯微孔滤膜上、过夜干燥并水化Matrigel。Transwell上室为2×105个HepG-2细胞（细胞活力＞95%），下室为含 10μg/ml Fibronectin完全培养基600μl，每组设 6 个平行孔，37℃常氧或缺氧孵育12h、24h。取出 Transwell小室，PBS洗 2次，用灭菌棉签擦去滤膜上表面未穿膜的细胞和Matrigel，95%酒精固定15分钟，HE染色，随机选择10个100×视野并计数。

1.5 各组HepG-2细胞AFP、ICAM-1mRNA表达

Trizol一步法提取细胞总RNA，电泳见28S、18S条带，以 2.5μg总 RNA为模板，以 Takara公司的Random Premier为引物进行逆转录反应合成cDNA。AFP和β-actin PCR的反应条件为：95℃预变性3分钟后，95℃ 变性 30s、60℃退火 30s、72℃延伸 50s共35个循环，72℃延伸7分钟。ICAM-1和β-actin PCR的反应条件为：95℃预变性3分钟后，95℃ 变性30秒、57℃退火30秒、72℃延伸50秒共35个循环，72℃延伸7分钟。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，以 AFP/β-actin和 ICAM-1/β-actin值分别表示AFP、ICAM-1 mRNA含量。

1.6 各组HepG-2细胞ICAM-1蛋白表达

1.6.1 培养细胞和取样取对数生长期的HepG-2细胞，按每孔5×105个接种于6孔板，常氧组HepG-2细胞于常氧培养24小时；缺氧12、24小时组HepG-2细胞于缺氧培养12、24小时，收集细胞，离心，PBS洗涤2次，用75%冷乙醇（4℃）固定，4℃保存。

1.6.2 采用免疫荧光间接法 检测细胞前经1500rpm离心5分钟，弃去乙醇，PBS洗涤2次，加20μl（1：20）兔抗人ICAM-1抗体，37℃水浴30分钟，PBS洗涤2次，加20μl（1：50）羊抗兔IgG-FITC荧光标记二抗，另设不加ICAM-1抗体只加IgGFITC荧光标记二抗作为空白对照组，37℃水浴30分钟，PBS洗涤2次，4℃保存，待测。

1.6.3 流式细胞仪检测 采用美国Becton-Dickson公司的FACSan流式细胞仪进行检测，每样品收集1×105个细胞，用 Clifit软件进行分析，参照Morkve［4］等提出的荧光指数（Fluorescence index，FI）表示ICAM-1蛋白的相对含量。

1.7 各组HepG-2细胞培养上清AFP含量的测定

取处于对数生长期的HepG-2细胞，按每孔1×105个细胞接种于24孔培养板，常氧组HepG-2细胞于常氧培养24小时；缺氧12、24小时组HepG-2细胞于缺氧培养12、24小时；吸取细胞培养上清经1000rpm离心15分钟，取上清用于AFP含量的RIA检测。

1.8 统计学处理

应用SPSS13.0统计软件进行统计学分析，计量资料用表示，多样本均数比较采用单因素方差分析，多样本均数间两两比较用q检验。

2 结 果

2.1 HepG-2细胞AFP、ICAM-1mRNA表达

常氧组和缺氧12h、24小时组总RNA的28S/18S=2：1，表明所提取的总RNA完整性好，可用于RT-PCR实验。图1、2和表1示：随着缺氧时间的延长HepG-2细胞的AFP、ICAM-1 mRNA表达量明显增高（P＜0.01），两者正相关（r=0.754，P＜0.05）。提示缺氧应激上调 HepG-2细胞 AFP、ICAM-1 mRNA表达。

2.2 HepG-2细胞AFP、ICAM-1蛋白表达

随着缺氧时间的延长HepG-2细胞的AFP、ICAM-1蛋白表达量明显增高（P＜0.01），两者正相关（r=0.769，P＜0.05）。提示缺氧应激上调HepG-2细胞 AFP、ICAM-1蛋白表达（见表1）。

表1 缺氧应激对HepG2细胞ICAM-1及AFP分子表达的影响（N=6，±SD）

表1 缺氧应激对HepG2细胞ICAM-1及AFP分子表达的影响（N=6，±SD）

注：*：与常氧组比较P＜0.01；#：与缺氧12h组比较 P＜0.01

值）常氧组 0.037±0.001 0.51±0.02 26.17±3.38 0.42±0.05 55±5 0.26±0.01缺氧12h组 0.051±0.002* 0.68±0.03* 44.25±3.87* 0.52±0.05* 67±4* 0.30±0.01*缺氧24h组 0.080±0.002*# 0.84±0.03*# 52.70±4.03*# 0.59±0.06*# 91±3*# 0.37±0.02*#组别 ICAM-1蛋白表达ICAM-1mRNA表达AFP蛋白表达（ng/ml） AFPmRNA表达 侵袭细胞数（个/HP）增殖活性（A

2.3 缺氧应激下HepG-2细胞增殖活性的改变

表1显示：随着缺氧时间的延长HepG-2细胞的增殖活性明显增高（P＜0.01）。HepG-2细胞增殖活性与 AFP蛋白及 mRNA表达呈正相关（r=0.691、0.781，P ＜0.01）。

2.4 缺氧应激下HepG-2细胞侵袭力的改变

表1显示：随着缺氧时间的延长HepG-2细胞的侵袭能力明显增高（P＜0.01）。侵袭力和ICAM-1蛋白及mRNA表达呈正相关（r=0.742、0.754，P ＜0.01）。

图1 HepG-2细胞AFP mRNA表达

图2 HepG-2细胞ICAM-1 mRNA表达

图3 A、B、C分别表示常氧、缺氧12h、24hHepG-2细胞ICAM-1蛋白表达

3 讨 论

肿瘤侵袭、转移是多因素、多步骤的生物学过程，其发生有赖于肿瘤细胞运动侵袭能力增强、不同时相细胞粘附与解粘附、降解并穿过细胞外基质进入血液和淋巴循环［1］。实体瘤存在着缺氧的局部微环境，缺氧时缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）-1α基因表达上调，转位到细胞核内与HIF-1β形成异二聚体HIF-1，HIF-1与其靶基因启动子或增强子的缺氧反应元件（hypoxia response element，HRE）5′-ACGTGC-3′结合，上调靶基因的表达，使肿瘤细胞增殖活性、侵袭和转移能力增强，糖酵解途径上调、对化疗药物耐药性增强，对放疗敏感下降［1］。前期的研究表明缺氧应激下 HepG-2细胞HIF-1表达［2］。本研究显示：缺氧应激下人HepG-2细胞的侵袭能力、增殖活性增强，与文献［1］相一致。

AFP基因属于白蛋白基因家族，有3个增强子，是原发性肝细胞癌诊断的重要血清标记物，参与细胞增殖和代谢的调节，能促进肝癌细胞增殖［5］。研究表明沉默AFP启动子抑制肝癌细胞的增殖活性［6］。本实验显示：缺氧应激下人 HepG-2细胞AFP基因的表达上调，增殖活性增强，且两者呈正相关；提示缺氧应激下HepG-2细胞增殖活性增强的机制之一是HepG-2细胞AFP基因的表达上调。

人ICAM-1（又名 CD54）基因长 15.5Kb，有7个外显子和6个内含子，定位于染色体19p13.2-13.3区，编码由4个前后排列的免疫球蛋白样区域组成的糖蛋白，是介导细胞间识别和粘附的重要粘附分子［7］。曲增强等研究发现：ICAM-1基因是肝癌细胞生物学行为的标志物之一。ICAM-1高表达的肝癌细胞转移能力增强，其可能的机制是：高表达ICAM-1的肝癌细胞通过LFA-1与浸润性淋巴细胞紧密结合，肝癌细胞间粘附力降低，易于随淋巴细胞的迁移脱离母瘤，与淋巴细胞结合的肝癌细胞在穿越血管壁时可以免受伤害，在血循环中易于形成栓子，逃逸免疫监视，易于在毛细胞血管内或淋巴窦滞留，形成转移灶［8］。本实验显示：缺氧应激下人HepG-2细胞ICAM-1基因的表达上调，侵袭力增强，与 Indovina［9］结果一致。ICAM-1 基因表达与HepG-2侵袭力呈正相关；提示缺氧应激下HepG-2细胞侵袭力增强的机制之一是HepG-2细胞ICAM-1基因的表达上调。

AFP、ICAM-1基因表达正相关，与 Zhang等［10］研究结果一致，提示两者可能在缺氧应激下HepG-2细胞增殖、侵袭能力增强中起协同作用，有待于进一步研究明确。AFP、ICAM-1基因是否是HIF-1的靶基因，有待于进一步研究证实。

［1］Jacques P，Frédéric D.Hypoxia signalling in cancer and approaches to enforce tumour regression［J］.Nature，2006，441（7092）：437-443.

［2］卢根林，邓勇，樊海宁，等.缺氧应激对HepG-2增殖活性和 HIF-1α、MMP-2 表达的影响［J］.青海医学院学报，2007，28（4）：485-490.

［3］卢根林，邓勇，樊海宁，等.缺氧应激对缺氧应激对人肝癌细胞粘附、侵袭和迁移能力的影响［J］.第三军医大学学报，2008，30（8）：721-723.

［4］Morkve O，Leaerum OD.Flow cytometry measurement of p21，p53 protein expression and DNA content in paraffin embedded tissues from bronchial carcinoma［J］.Cytometry，1991，12（5）：438-44

［5］Wang XW，Xie H.Alpha-fetoprotein enhances the proliferation of human hepatoma cells in vitro［J］.Life Sci，1999，64（1）：17-23.

［6］Gao P，Wang R，Shen JJ，et al.Hypoxia-inducible enhancer/alpha-fetoprotein promoter-driven RNA interference targeting STK15 suppresses proliferation and induces apoptosis in human hepatocellular carcinoma cells.Cancer Sci，2008，99（11）：2209-2217.

［7］Vassilis GG，Panayotis Z，Athanassios K，et al.p53 activates ICAM-1（CD54）expression in an NF-kB-independent manner［J］.The EMBO Journal，2003，22（7）：1567-1578.

［8］曲增强，吴孟超，谢天培，等.I型细胞间粘附分子在肝细胞癌中的表达及其意义［J］.中华病理学杂志，1997，26（2）：：82-84.

［9］Indovina P，Rainaldi G，Santini MT.Hypoxia increases adhesion and spreading of MG-63 three-dimensional tumor spheroids［J］.Anticancer Res，28（2A）：1013-1022.

［10］Zhang H，Miao Z，He Z，et al.The existence of epithelialto-mesenchymal cells with the ability to support hematopoiesis in human fetal liver［J］.Cell Biol Int，2005，29（3）：213-219.

Effects of hypoxia stress on expressions of AFP and ICAM-1 in HepG-2 cell

LU Genlin1，DENG Yong2，YAN Xingjun1
（1.Yiwu Central Hospital，Zhejiang 322000，China；2.the Affiliated Hospital of Qinghai University，Xining 810001，China）

ObjectiveTo investigate whether hypoxia stress regulates expressions of AFP and ICAM-1 in HepG-2 cell.MethodHepG-2 cells were cultured under hypoxia（5%O2，5%CO2and 90%N2）for 12，24 h or normoxia.The proliferation in HepG-2 cell was detected by methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）.Cell invasion and migration assay was used to decide the invasion in HepG-2 cell.The expressions of AFP and ICAM-1 mRNA in HepG-2 cell were determined by reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）.The expression of ICAM-1 protein in HepG-2 cell was studied by flow cytometry assay.The expression of AFP protein in HepG-2 cell was determined by radio-immunity assay（RIA）.ResultWith the hypoxia time extending，the expressions of AFP and ICAM-1 gene were dramatically enhanced（P＜ 0.01）.ConclusionUp-regulation of AFP and ICAM-1 contributes to the enhancement of proliferation，invasion in HepG-2 cell by hypoxia stress respectively.

hypoxia stress；HepG-2 cell；AFP；ICAM-1

R364.4；R73-37

A

1672-0024（2012）01-0044-04

卢根林（1973-），男，浙江衢州人，硕士，主治医师。研究方向：普通外科学

青海省卫生厅2006年指导性科研项目（编号：200601）