PAS和CK双重染色法在胃粘膜活检标本中的应用

虞佳燕，丁国芳

（1.舟山医院，浙江 舟山316004；2.浙江海洋学院医学院，浙江 舟山316004）

PAS和CK双重染色法在胃粘膜活检标本中的应用

虞佳燕1，丁国芳2

（1.舟山医院，浙江 舟山316004；2.浙江海洋学院医学院，浙江 舟山316004）

目的：通过运用免疫组化染色和黏液特殊染色2种染色方法，对同一张胃镜活检标本进行PAS和CK的双重染色，提高胃镜活检标本的利用率以及微小癌灶的检出率。方法：选取本院2010年胃镜诊断胃黏膜重度非典型增生和各型腺癌标本134例，在同一张切片上先实行PAS染色，然后实行CK染色，其结果与H-E染色进行比较。结果：中性黏液PAS染色胞浆呈紫红色，胞核呈蓝色；胃腺癌细胞质CK阳性，呈棕黄色，双重染色阳性116例，H-E染色阳性100例，χ2检验分析，P＜0.05，有统计学意义。结论：双重染色在胃镜活检黏膜中的应用可以有效提高胃镜活检标本的利用率和早期胃癌的检出率，值得在广大基层医疗机构推广。

胃镜活检；免疫组化；粘液特染；双重染色；病理诊断

胃癌是在各种恶性肿瘤中发病率和死亡率非常高的肿瘤［1］，内镜下取活检是早期诊断胃癌最准确和直接的方法，不仅可以了解肿瘤的部位、大小、大体类型，还能进行病理分型，已得到广泛应用［2］。但是通常胃镜活检黏膜常规制片后发现微小癌巢，需要做免疫组化染色和黏液特殊染色才能进一步确诊，但常遇到活检标本太小，重新切片时癌组织已缺如，无法对上皮细胞进行免疫标记以及采用黏液特殊染色进行标记，给临床病理诊断带来较大困难。针对我院每年有一万余例胃黏膜活检标本，我们经过反复实验，发现在同一张切片上进行上皮细胞角蛋白免疫组织化学染色标记（cytokeratin，CK）和黏液染色标记（periodic acid schiff，PAS），可有效解决这一难题。

1 材料与方法

1.1 材料

选取本院2010年1月至2010年12月送检胃镜诊断重度非典型增生16例，高分化腺癌标本62例，低分化腺癌标本30例，粘液腺癌标本26例。经10%福尔马林固定，常规脱水，透明，切片石蜡包埋，切片厚3～4μm，裱在涂有防脱片剂的（10%多聚赖氨酸）清洁载玻片上。全部标本进行连续切片，采用PAS和CK双重染色，将单一的H-E染色与双重染色作对照。

1.2 试剂

（1）0.5%过碘酸水溶液：过碘酸0.5g，蒸馏水加至 100mL；（2）无色品红液：碱性品红 1g，蒸馏水200mL，1mol/L盐酸20ml，偏重亚硫酸 1.5g，活性碳1.5g；（3）免疫组化试剂：一抗（鼠抗人）CK 及 EnVision试剂（即用型）均购自福州迈新生物技术公司。另备用 0.01mol/L pH7.4PBS，0.01mol/L pH7.8 TBS，3，3- 二氨基联苯胺盐酸盐（DAB），热修复介质0.01mol/L pH6.0柠檬酸缓冲液。

1.3 方法

1.3.1 操作步骤

第一步：黏液特殊染色（PAS），石蜡切片60°C烤箱过夜，切片脱蜡水化后，按过碘酸—无色品红法染中性黏液：（1）0.5%过碘酸水溶液氧化10分钟，流水冲洗2分钟；（2）入无色品红液于暗处加盖作用10～20分钟，流水冲洗2分钟；（3）以0.2%稀醋酸溶液作为洗脱液将切片洗3分钟×3次。

第二步：免疫组化染色 采用EnVision二步法进行的细胞角蛋白标记（CK）。蒸馏水浸洗3分钟×3次，PBS缓冲液充分冲洗 PBS浸洗3分钟×3次；（1）高温修复（柠檬酸）2分钟，冷却，PBS浸洗3分钟×3次。（2）3%过氧化氢37°C孵育10分钟，PBS浸洗 3分钟 ×3次；（3）滴加一抗 37°C孵育60min，PBS浸洗 3分钟×3次；（4）滴加二抗37°C 孵育30分钟，PBS浸洗3分钟×3次。DAB显色，镜下观察显色效果，自来水冲洗3分钟。Harris苏木素复染2分钟，水洗，1%盐酸分化，流水冲洗10分钟。梯度酒精脱水，中性树胶封固。

双重染色后，显微镜下观察PAS和CK双染表达情况。

1.3.2 统计学处理 采用SPSS11.3统计软件包处理，所有实验数据进行χ2检验，以 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 H-E染色与CK和PAS双重染色阳性率比较

除高分化腺癌经H-E染色与CK和PAS双重染色阳性率没有差异外，其余3种病变双重染色的阳性率都高于H-E染色。差异具有统计学意义（P ＜0.05）。见表 1。

表1 H-E染色与CK和PAS 双重染色的比较

2.2 PAS和CK在重度非典型增生的胃粘膜与高分化腺癌的对比表达

图A为H-E染色交界性病变的胃黏膜，经CK染色间质中见散在的阳性细胞（图B），PAS染色后粘液在腺细胞内明显，间质中也见部分阳性细胞（图C）。CK及PAS双重染色，细胞质和少量细胞核呈棕黄色（图D）。

图1 胃腺癌标本经双重染色和单一染色阳性表达

3 讨论

黏液特殊染色（PAS）能很好显示糖原及中性黏液，在胃癌黏膜表面上皮和癌细胞组织内PAS均呈阳性，因此可以鉴别癌细胞是否浸润间质［3-4］。但是用于特殊染色的高碘酸液配制必须新鲜。免疫组化染色中CK主要标记胃肠道上皮，用于诊断胃肠道腺癌。随着高温高压抗原修复技术逐渐被实验室认可和应用［5］，免疫组化染色过程中采用高温高压修复。于高压锅出蒸汽90s后迅速移开热源，放置于事先备好的冷水中冷却。修复时间过长，易导致非特异性染色，不足则不能充分暴露抗原决定簇［6］。

如图A所示，H-E染色的交界性病变，通常不能明确诊断为重度非典型增生或高分化腺癌。因此需要做CK染色（图B）和PAS染色（图C），然后再对比2张切片中相同组织的显色情况，以此鉴别诊断。但是工作中经常遇到胃镜下钳取活检标本体积小、量少、较浅表，组织经过反复切片有诊断意义的部位容易被切去，故而找不到相同组织的对照部位，并且分别单项染色步骤烦琐。我们在一张组织切片中相继做黏液特殊染色与免疫组化双重染色（图D），无异于连续切片后单独染色，避免了反复切片，缩短了时间，并且有效避免了由于病灶较小被切完的可能性。双重染色后生成物显示在组织细胞的不同部位，黏液湖中散在棕黄色肿瘤细胞，各种染色显示的颜色不相互遮盖、不相互干扰，且色彩鲜艳，对比明显，定位清晰，染色效果佳，与H-E常规染色切片比较，结果令人满意。根据本文结果分析显示，该技术在胃黏膜重度非典型增生和低分化腺癌以及黏膜黏液腺癌的诊断中，能及时为临床提供准确的病理诊断，对患者治疗及愈后提供了积极的帮助。

运用CK和PAS双重染色法可以提高胃镜微小活检标本的利用率，同时提高早期胃癌、低分化腺癌和粘液腺癌的检出率，同时该方法也可以用于外地来会诊的单张切片。双重染色有助于明确诊断，并且该方法操作易行，用材简便经济，值得在基层医疗机构推广。

［1］李明今，崔银姬，李柱虎，等.胃癌中CD44s和 CD44V6的表达及意义［J］.临床与实验病理学杂志，2009，25（1）：417-418.

［2］Karube T，Ochiai T，Shimada H ，et a1.Detection of sentinel lymph nodes in gastric cancers based on immunohistochemical analysis of micrometastases［J］.Surg Oncol，2004，87（1）：32.

［3］王军，青年人胃镜活检胃癌62例临床分析［J］.内蒙古中医药，2010，29（12）：64-65.

［4］Trere D，Ceccarelli C，Migaldi M，et al.Cell proliferation in breast cancer is a major determinant of clinical outcon，in node-positive but not in node-negative patients［J］.Appl Immunohistochem Mol Morphol，2006，14（3）：314-323.

［5］凌启波.实用病理特殊染色和组织化学技术［M］.广州：广东高等教育出版社，1989.72-73.

［6］孟奎，周晓军.免疫组织化学病理诊断中抗体及检测系统的选择［J］.临床与实验病理学杂志，2004，20（5）：629-631.

Application of double dyeing technique in gastroscope biopsy specimens

YU Jiayan1，DING Guofang2
（1.Zhoushan Hospital，Zhejiang 316004，China；2.Medical College of Zhejiang Ocean University，Zhejiang 316004，China）

ObjectiveBy using immunohistochemistry and mucoid special staining，a gastroscope biopsy specimens were dyed by the CK and PAS to improve the utilization rate of the gastroscope biopsy specimens and the detection rate of small cancer lesion.MethodSpecimens from 90 patients diagnosed as adenocarcinoma in 2010 were dyed first by immunochemistry and then by mucoid special staining.ResultCancer cells are tan-yellow in the CK positive；Cytoplasm is purple and the nucleuses appear blue in the neutral mucous PAS staining.ConclusionApplication of double dyeing technique in endoscopic biopsy mucosa can be effectively improved the utilization ratio and tiny cancer detection rate.It is worth applying in the basic-level hospital.

gastroscope biopsy；iImmunohistochemistry；special dye；double dyeing；pathology diagnosis

B

1672-0024（2012）01-0048-04

虞佳燕（1981-），女，浙江舟山人，本科，技师。研究方向：消化道疾病病理技术

舟山市科技局科技计划项目（编号：2010-134）