癌痛消颗粒对移植性肝癌模型大鼠肝癌及癌旁组织miRNAs的影响※

黄 峰 韦艾凌

(湖南中医药大学2010级博士研究生，湖南 长沙 410208)

原发性肝癌(primary liver cancer，PLC)是临床上常见的恶性肿瘤之一，应用中医药治疗主要以改善症状、提高生活质量、增强放化疗药物的敏感性等达到减毒增效作用，有着确切的临床疗效，日益在癌症的治疗中显示出重要价值，已成为综合治疗中不可缺少的手段之一。开展中医药治疗PLC的实验研究将有助于进一步了解中医药治疗的机制。癌痛消颗粒是广西中医药大学第一附属医院韦艾凌教授在膈下逐瘀汤的基础上加减而成的经验方剂，本实验拟采用癌痛消颗粒干预治疗移植性肝癌模型大鼠后，通过实时定量PCR(RT-PCR)技术检测微小核糖核酸(miRNAs)miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-18 在肝癌及癌旁组织中的表达情况，以探讨癌痛消颗粒治疗PLC的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SD雄性大鼠70只，清洁级，体质量(200±20)g，取60只用于制作移植性肝癌大鼠模型，10只作为空白对照。断奶Wistar雄性大鼠6只，清洁级，体质量50～70 g，用于癌细胞增殖传代，每周传代1次，形成癌性腹水后制作瘤细胞悬液，以供移植性肝癌造模之用。所有动物分笼饲养，饲养于广西中医药大学第一附属医院清洁级动物实验室。实验大鼠均购于广西医科大学实验动物中心，动物生产合格证号：SCXK2009-0002。

1.1.2 实验瘤株 Walker-256癌肉瘤，保存在广西中医药大学第一附属医院-80℃冰箱的瘤株，原购于武汉大学中国典型培养物保藏中心，为Walker-256腹水型Wistar大鼠，质量约80 g。

1.1.3 药品 癌痛消颗粒由广西中医药大学第一附属医院制剂中心制备，主要药物组成：白花蛇舌草、半枝莲、赤芍药、延胡索、香附、乌药、黄芪、绞股蓝、三棱、莪术、红花、甘草，每克相当于原药材生药4.86 g;氟尿嘧啶注射液(5-Fu，上海旭东海普药业有限公司，国药准字H31020593)。

1.1.4 试剂 miRcute miRNA提取分离试剂盒、RNAstore样品保存液均购自天根生化科技(北京)有限公司，逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒、固相表面RNase清除剂均购自宝生物工程(大连)有限公司，RPMI-1640、高糖DMEM(Gibco公司)，低熔点琼脂糖(Sigma公司)。

反转录、定量PCR引物与探针：Rat-miR-199a-5p 5'-CCCAGTGTTCAGACTACCTGTTC-3';Rat-miR-199a-3p 5'-ACAGTAGTCTGCACATTGGTTA-3';RatmiR-18 5'-TAAGGTGCATCTAGTGCAGATA-3由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

1.1.5 仪器设备 巴尔贝斯BBS-SDC净化工作台(济南安赛医疗器械有限公司);Eppendorf5417R冷冻离心机;SIM-F140AY65制冰机;美国伯乐Gel Doc XR System全自动凝胶成像系统;DNA Engine Opticon荧光定量PCR仪(MJ Research，Incorporated);BSC-1500IⅡB2-X 生物安全柜(郑州南北仪器设备有限公司);LT-1005台式低温恒温槽(上海双旭电子有限公司);K5500超微量分光光度仪(北京凯奥科技发展有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 建立模型 将70只SD大鼠随机分为空白对照组10只和造模组60只，适应性喂养1周，空白对照组正常饲养，造模组采用肝内直视下直接注射法造模。方法：断奶Wistar雄性大鼠6只，分别腹腔注入Walker-256癌肉瘤和瘤鼠腹水，形成腹水后分别抽取癌性腹水5 mL，以1 200 r/min的速度离心2 min，摒弃上清液，用0.9%氯化钠注射液洗涤再次离心1次，取稀糊状浓缩的瘤细胞悬液备用。实验用SD大鼠术前禁食8～12 h，2%戊巴比妥钠按40 mg/kg剂量腹腔注射麻醉，麻醉成功后取仰卧位，用橡皮筋固定四肢于实验板上，自剑突下沿腹正中剪去体毛，用2%碘伏和75%酒精消毒后，沿腹白线逐层切开约1.5 cm，暴露大鼠腹腔，轻压大鼠胸腔，托出肝左外叶，用1 mL注射器先抽取空气0.1 mL，再抽取浓缩的瘤细胞悬液0.05 mL，针头与肝脏表面呈30°角斜刺入鼠肝左外叶约0.5～0.8 cm，缓慢注入瘤细胞悬液 0.05 mL 后继续推入空气0.03 mL，快速拔针以防止瘤细胞悬液顺针道逆流，穿刺点用棉签压迫3～5 min，观察无活动性出血后轻送肝脏还纳腹腔，关腹。术后前3 d按10万单位/(只·d)肌肉注射注射用青霉素钠，于造模第7 d随机抽取7只(空白对照组2只，造模组5只)大鼠处死取肝脏，通过病理组织学检查证实造模成功。

1.2.2 动物分组及给药方法 将剩余55只造模组大鼠随机分成癌痛消颗粒高、中、低剂量组及5-Fu对照组、蒸馏水对照组，每组11只，空白对照组大鼠8只。于造模后第8 d开始对癌痛消颗粒高、中、低剂量组予癌痛消颗粒溶液(药物浓度为0.6 g/mL)按 2 mL、1 mL、0.5 mL 灌胃给药，每日2次，连续治疗14 d后停药;5-Fu对照组采用5-Fu按75 mg/(kg·d)腹腔注射治疗，每隔2 d 1次，共5次;蒸馏水对照组予蒸馏水每日2 mL灌胃，连续治疗14 d。各组均停药24 h后颈椎脱臼处死大鼠，严格消毒后开腹取出癌块和癌旁组织，迅速以液氮冷冻，放入-80℃冰箱冷藏待检。空白对照组大鼠不进行造模及施加处理因素，在相同的观察时间内进行正常饲养，供实验结束时作空白对照用。

1.3 肝癌及癌旁组织miRNAs表达的检测

1.3.1 肝癌及癌旁组织总 RNA的提取 参照 miRcute miRNA提取分离试剂盒说明进行操作，用miVanaTM miRNA Isolation Kit分离miRNA。将提取的RNA用1.2%琼脂糖进行电泳(图1)，用K5500超微量分光光度仪检测浓度及纯度。

1.3.2 逆转录 参照逆转录试剂盒说明书，应用TRIzol一步法分别提取组织和细胞中总RNA，逆转录得到cDNA。

1.3.3 扩增检测 将miRNA逆转录成cDNA，进行实时定量PCR扩增和检测。采用SYBR Green Ι染料法进行检测，提取各样本总RNA进行反转录，获得的cDNA以5次方等比稀释上机摸索最佳模板浓度和扩增效率。反应条件为 94 ℃ -30 s，95 ℃ -10 s，58 ℃ -20 s，60 ℃ -20 s，plate read，40cycles，解链曲线60～95℃，由软件自动生成扩增曲线和熔解曲线并设定基线。从熔解曲线可见反应过程无引物二聚体和非特异扩增(图2)，保证数据的可靠性。本次试验数据统计采用2-ΔΔCt方法进行。

1.4 统计学方法 应用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验。

2 结果

各组大鼠肝癌及癌旁组织miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-18表达的测定CT值比较 见表1。

表1 各组大鼠肝癌及癌旁组织miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-18表达的CT值比较 ±s

表1 各组大鼠肝癌及癌旁组织miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-18表达的CT值比较 ±s

与空白对照组比较，* P＜0.05;与蒸馏水对照组比较，△ P＜0.05;与5-Fu对照组比较，#P＜0.05;与癌痛消颗粒高剂量组比较，＆P＜0.05

组 别 n miR-199a-3p miR-199a-5p miR-18肝癌组织 癌旁组织癌痛消颗粒高剂量组 11 13.37±1.57＊△# 5.72±0.61＊△# 4.54±0.86＊△# 2.02±1.92＊△# 0.72±0.20＊△# 0.48±0.55＊△#肝癌组织 癌旁组织 肝癌组织 癌旁组织癌痛消颗粒中剂量组 11 18.08 ±1.50＊△#＆ 7.71 ±1.85＊△#＆ 7.67 ±1.7＊△#＆ 3.05 ±0.59＊△#＆ 0.08 ±0.35＊△#＆ 0.39 ±0.72＊△#＆癌痛消颗粒低剂量组 11 2.37 ±0.71＊△ 1.80 ±0，.53＊△ 1.27 ±0.311＊△ 1.09 ±0.651＊△ 0.91 ±0.421＊△ 0.46 ±0.731＊△5-Fu 对照组 11 2.02 ±1.23＊△ 1.72 ±0.63＊△ 1.25 ±0.38＊△ 1.43 ±0.48＊△ 0.86 ±1.03＊△ 1.43 ±0.67＊△蒸馏水对照组 11 0.48 ±0.03* 0.45 ±1.60* 0.50 ±0.08* 0.60 ±0.18* 3.48 ±1.04* 1.70 ±0.16*空白对照组1 ±0.56 1 ±0.29 1 ±0.21 8

由表1可见，癌痛消颗粒高、中、低剂量组及5-Fu对照组、蒸馏水对照组 miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-18表达的CT值与空白对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05);癌痛消颗粒高、中、低剂量组及5-Fu对照组 miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-18 表达的 CT值与蒸馏水对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，癌痛消颗粒高、中剂量组与5-Fu对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，癌痛消颗粒低剂量组与5-Fu对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，癌痛消颗粒中剂量组与高剂量组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

目前PLC全球发病率呈上升趋势，我国年发病率约为34/10万人，每年新发病患者超过10万，每年约有23万人死于肝癌，约占全世界肝癌死亡数的45% ～53%［1］。PLC给患者、家庭及社会造成了极大的影响和负担，因此PLC的诊断、治疗和预防就显得尤为重要。

PLC的发生、发展是多因素、多步骤的复杂过程，通过寻找PLC发生、发展的相关基因，了解PLC的分子遗传学机制为PLC的诊断、个体化治疗提供理论基础已成为目前国内外医学界研究的热点。miRNAs是一类大约22 nt大小的保守非编码小RNA，主要通过转录后对其靶基因表达进行负性调控［2］，以mRNA为靶标可在不同水平上调节基因表达，据推测miRNAs能够调节人类1/3的基因，参与细胞发育、增殖、分化、凋亡等一系列重要生物学进程［3］。

目前已发现若干miRNAs直接参与肝细胞癌变的发生和发展，肝癌组织中miR-18、pre-miR-18及miR-22较正常组织有更高水平的表达，miR-199a、miR-195、miR-199a、miR-200a及miR-125a表达水平则降低，依据这些差异表达的miRNAs来区分癌变组织与正常组织的精确度可达到97%［4］。

中医学认为，PLC属肝积等范畴，是由于多种原因导致体内毒聚、血瘀、正虚的改变，日久导致毒结不通，血瘀不行，气机升降出入失常，阻于胁下，继而发病［5］。根据PLC“毒、瘀、虚”的病机特点，解毒、化瘀、扶正是其基本治法。膈下逐瘀汤出自清·王清任《医林改错》，具有活血化瘀、行气止痛、破癥消积之功，主治膈下瘀阻气滞，形成痞块等，韦艾凌教授正是根据自己多年临床经验在原方基础上加减而成癌痛消颗粒。方中以白花蛇舌草、半枝莲为君，清热解毒，散瘀止痛，直击肝癌肇因;赤芍药、延胡索、香附疏肝理气，活血止痛，为臣药;乌药、黄芪、绞股蓝、三棱、莪术清热解毒，活血祛瘀，补脾益气，养阴生精，散结止痛，为佐药;红花专入心、肝血分，活血通络，甘草调和诸药，共为使。诸药合用，组方严谨，切合肝癌病机，可以攻补兼施、气血同治、肝脾同调，具有祛邪不伤正、扶正不留邪的特点。

中药一般是通过多种途径、多个环节发挥抗癌作用，癌痛消颗粒为中药复方制剂，药味较多，成分复杂，有研究表明癌痛消颗粒可下调大鼠移植性肝癌的血管内皮生长因子(VEGF)和微血管密度(MVD)表达，具有一定抑制Walker-256移植性肝癌血管生成的作用［6］，还可以下调肝癌细胞bcl-2基因蛋白的表达，具有诱导凋亡作用［7］。为进一步探讨癌痛消治疗肝癌的机制，本实验有针对性的引入观察其对 miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-18表达的影响。实验研究结果表明，癌痛消颗粒各剂量组对肝癌及癌旁组织组织miRNAs的表达均具有调节作用，能够降低miR-18的表达，升高miR-199a-3p、miR-199a-5p的表达，且以癌痛消颗粒中剂量组的疗效最佳，其抗癌作用机制可能就与调节PLC的不正常miRNAs表达有关。

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［5］韦艾凌，唐健，陈逸恒，等.癌痛消颗粒治疗原发性肝癌血瘀毒结兼正虚证疗效分析［J］.辽宁中医杂志，2007，34(5)：570-572.

［6］魏录翠，韦艾凌，唐健，等.癌痛消颗粒调节大鼠移植性肝癌VEGF和MVD表达的实验研究［J］.辽宁中医药大学学报，2008，10(8)：159-161.

［7］魏录翠，韦艾凌，黄小琪.癌痛消颗粒对大鼠移植性肝癌细胞凋亡及Bcl-2表达影响的研究［J］.江西中医学院学报，2008，20(3)：82-84.