应激状态对颞下颌关节内P物质影响的实验研究

王晓菲

颞颌关节病 （temporomandibular disorders，TMD）是人群中的一种常见病和多发病，治愈率低，病因复杂，临床表现为一系列颞颌关节及附近组织疼痛、张口受限等症状，严重影响患者的生存质量[1]。研究表明，SP广泛分布于 TMJ（temporomandibuar joint）中，与TMJ病变的发生、发展密切相关[2]。与包括关节软骨在内的各种骨代谢有密切的关系[3，4]。目前，TMJ内SP的相关应研究多为定性研究，缺乏明确的定量研究来观察应激后TMJ内SP的变化。因此，本研究在建立应激动物模型，通过定量观察应激前后TMJ内SP相关神经肽的变化，探讨应激因素与TMD的关系。

1 材料和方法

1.1 材料 SD大鼠，一级，60只，体重（150±10）g，雄性，由山东大学动物中心提供。

1.2 仪器与设备 随机应激仪，自制，装置分为两部分即刺激仪和刺激笼。刺激仪在结构上由随机发生器和输出电路组成。随机发生器由2个震荡器形成随机组合的脉冲，经延时后控制连续波发生器，后者产生4 Hz的连续频率，它的持续时间即刺激时间可在2、5、10 s内选择，随机形成的连续波经输出电路输出，输出脉冲的空载幅度为150 V。

1.3 实验动物分组和方法 将60只大鼠分为空白对照组、电击组（foot-shocked，FS）、应激组（emotional stress，ES）和药物对照组（anti-anxiety-drug，AAD）15只/组。以上各组又随机分为10、20、30 d三个亚组，5 只/组。

1.4 建模 模型建立时参考Rosales等[5，6]的模型。电击组：每天固定时间给予电击，30 min/d，电压80 V，应激频率4 Hz，以维持受刺激动物惊恐、紧张和愤怒的应激状态。应激组：电击组受电击后排便，竖毛，尖叫等反应影响该组大鼠。药物对照组：试验前30 min给抗焦虑抑郁注射液注射量为1 mg/kg。空白对照组：不给予以上应激影响。各组大鼠的体重、性别通过均衡检验，证实无显著性差异。各组大鼠均为普通固体饲料，自由饮水，同等饲养。实验开始前1周，将大鼠放入交流箱中适应一段时间，不给予应激。应激时间设置为10 d组、20 d组和30 d组。其中电击组大鼠仅作为应激源，不参与实验测试。药物对照组与应激组大鼠一样，同期、同样的条件下开始实验，但药物对照组大鼠在实验前30 min皮下注射抗焦虑抑郁药。每天上午的固定时间给予应激，以严格对照，保证研究结论的可靠性。

1.5 RT-PCR 取大鼠髁突，将髁突液氮处理并研磨。常规方法提取收集TMJ髁突软骨组织的总核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），采用反转录脱氧核糖核（Complementary deoxyrlibonucleic acid，cDNA）合成试剂盒合成cDNA，设计引物序列进行RT-PCR扩增，β-actin用做内定参考。

引物设计如下：SP （252bp） 上游：5’-GAG CCCTT TGA GCAT CTTCT-3’； 下 游 ：5’-ACG CCTTCTTTCGTAGTTCTG-3’。β-actin （422bp）上游：5’-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3’；下游：5’-TCGGGGCATCGGAACCGCTCA-3’。

PCR 扩增：PCR 反应总体积 25 μl， 包括：PCR Mix 10 μl， 上、 下游引物共 1 μl，cDNA 模板 2 μl，H2O 12 μl。 PCR 条件为 95℃预变性 5 min，94℃变性 1 min，58℃和 56℃退火 1 min，72℃延伸1 min，35个循环后，最后一个循环72℃ 10 min。

取 SP 及 β-actin，扩增产物各 5 μl，混合后 2%琼脂糖凝胶电泳1 h。RT-PCR电泳结果经凝胶成像系统的分析软件进行量化处理，用β-actin作内参照，对SP基因表达的相对量进行分析。用SPSS15.0软件单因素方差分析对实验数据进行处理。

2 结 果

2.1 大体观察 实验中，FS组大鼠有跳跃，翘尾，竖毛等行为表现，ES组大鼠有竖毛、恐慌等应激行为表现。药物对照组没有竖毛、恐慌等应激表现。各组取材时，同性别大鼠平均体重相似。各组大鼠无意外死亡。

2.2 SPRT-PCR结果 以β-actin扩增产物作为内参照进行半定量分析：ES组SPmRNA的表达量最高，AAD组和对照组SPmRNA的表达量较低。统计结果显示，ES组、AAD组和对照组均有显著差异（P<0.05），AAD 组与对照组无显著性差异（P>0.05）。

10 d时，ES组SP表达最高。AAD组神经肽分子的表达略有升高，各组比较均有统计学差异（P<0.05）。20 d时，ES组相比10 d时显著降低 （P<0.05），高于对照组与AAD组；AAD组相比10 d水平显著降低 （P<0.05），与对照组无显著差异 （P>0.05）。30 d时ES组和AAD组SP的表达水平显著低于10 d与20 d（P<0.05），与对照水平无显著差异（P>0.05）。

图1 SPRT-PCR检测结果图

3 讨 论

TMD指发生在TMJ 区及相应的软组织的一类以肌肉的疼痛、异常关节音及下颌运动异常和伴有功能障碍为主要特征的一组疾病的总称，其在人群中的发病为20%～40%，是口腔医学临床最常见的疾病之一[7]。该病的病因比较复杂，对其病因和发病机理的研究表明，TMD是多种因素作用的结果，尤其与患者的情绪抑郁、环境压力有着密切的关系，应激因素对该病的发生、发展及预后有着重要的影响[8，9]。

20世纪50年代Schwartz等[10]报道了TMD与心理因素有关，此后关于应激对口颌系统健康的影响乃至其在口颌肌功能紊乱、TMJ疼痛的发生、发展和治疗效果方面的研究时有报道[10-13]，但迄今仍没有确凿的证据证明两者之间存在直接因果关系。本研究参考了Rosales等[5，6]的应激模型，并在此基础上证实了应激对TMJ具有一定的影响。

SP具有促进肥大细胞脱落，释放组胺及5羟色胺等各种伤害性刺激因子，诱导滑膜细胞中DNA和蛋白质的合成与分裂作用[14]。能与已知的滑膜细胞的另两种刺激因子白细胞介素-1和肿瘤坏死因子有相互作用，共同发挥对滑膜细胞的作用。如压力、精神紧张和炎症介质等，都能激活伤害感受器引起SP合成和释放增加。本文结果提示在应激因素引起的TMJ病变过程中的初期，SP合成和释放增加，会对表面滑膜细胞产生作用，致使表层胶原纤维的破坏；随着应激时间的延长，动物对应激的慢慢适应，SP合成和释放减少，症状可能会有所减轻。

本文结果说明应激对TMJ的影响可能是体内多种相关神经肽分子变化的作用。可为预防和治疗与应激相关的TMD提供理论依据。可为进一步阐明心理因素与TMD的关系提供了理论依据，对临床双轴诊断和治疗具有一定的理论指导义意。

[1]XU Weihua,MA Xuchen,GUO Chuanbin,et al.Psychological status in patients with temporomandibular disorders[J].Chinese Journal of Stomatology,2005,40（5）:359-361.

[2]Kido MA,Kiyoshima T,Kondo T,et al.Distribution of substance P and calcitonin gene-related peptide-like immunoreactive nerve fibers in the rat temporomandibu-lar joint[J].J Res,1993,72(6):592-598.

[3]Sun Yingming,Duan Yinzhong,Fan Chengtao.Effect of SP on intracellular free calcium concentration in cultured osteoblast[J].Chinese Journal of Stomatology,2001,36（6）:408-411.

[4]Konttinen Y,Imai S,Suda A.Neuropeptides and the puzzle of bone remodeling[J].Acta Orthop Scan,1996,67（6）:632-639.

[5]Rosales VP,Ikeda K,Hizaki K,et al.Emotional stress and bruxlike activity of the masseter muscle in rats[J].Eur J Orthod,2002,24（1）:107-117.

[6]Funada M,Hara C.Differential effects of psychological stress on activation of the 5-hydroxytryptamine and dopamine-containing neurons in the brain of freely moving rats[J].Brain Res,2001,901(3):247-251.

[7]Nicholson RA,Townsend DR,Gremling SE.Influenec of a scheduled-waiting task on EMG reactivity and oral habit among facial pial patients and no-pain concrols[J].Appl-Psychophysiol-Biofeed-back,2000,25（4）:203-19.

[8]Jager K,Schneider M.How do occlusion disorder and stress influence cybernetic masticatory control?[J]Schweiz Monatsschr Zahnmed,1992,102（5）:536-540.

[9]Schwartz LL.Pain associated with the temporomandibular joint[J].The Journal of the American Dental Association,1955,51(4):394-397.

[10]Goddard G，Karibe H．TMD prevalence in rural and urban Native American populations[J]．Cranio，2002，20（2）：125-128．

[11]Molin C．From bite to mind TMD-a personal and literature review[J]．Int J Prosthodont,1999,12（3）：279-288．

[12]Suvinen TI，Reade PC，Kemppainen P，et al．Review of aetiological concepts of temporomandibular pain disorders：towards a biopsychosocial model for integration of physical disorder factors with psychological and psychosocial illness impact factors[J].Eur Pain,2005,9（6）：613-633．

[13]Tsai CM,Chou SL,Gale EN,et al.Human masticatory muscle activity and jaw position under experimental stress[J].J Oral Rehabil,2002,29（1）:44-517.

[14]Cruwys SC.Sensory denervation with capsaicin attenuates inflammationand nociceptionin arthritic rats[J].Neurosci Lett,1995,67(3):235-243.