高效液相色谱梯度参数优化设置解析

张振巍，张娜娜，石 磊，张建民，白丹丹

进行高效液相色谱分析时，两种洗脱方法：等度洗脱和梯度洗脱。等度洗脱是由不同溶剂构成的固定比例的流动相，在整个洗脱过程中，流动相的极性、离子强度、pH值等因素皆保持不变。对于较复杂的中药成分来说，只单纯的用等度洗脱来分析中药的成分，显然有些力不从心，为此采用梯度洗脱，在此过程中可调节流动相的极性，改善样品中每个组分的分离度从而达到彻底分离的目的。本文以反相键合相高效液相色谱为例，并以实际中药材溶液作为样品，介绍用二元混合溶剂流动相进行梯度洗脱的一般步骤，并优化梯度洗脱参数的方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津LC2010CHT型高效液相色谱仪 （四元泵、在线脱气、自动冷却装置、全自动进样器、紫外检测器）；梅特勒-托利多AB135-S双量程电子天平 （瑞士）；AS10200ADT型超声波清洗器。色谱甲醇（山东禹王实业有限公司化工分公司，批号20110103061）；实验用水采用双重蒸馏水；其它试剂均为分析纯。

1.2 试药 以赤芍药材为样品，按照2005版药典第一部对赤芍药材进行处理得到样品溶液[2]。

2 优化梯度洗脱方法的一般步骤

色谱柱Shim-Pack VP-ODS C18色谱柱（250mm×4.6mm，5 μm)；流动相甲醇-0.1%磷酸梯度洗脱；流速为 1.0 ml/min；检测波长为227 nm；柱温30℃，流动相∶溶剂 A-B∶甲醇-水（φA可变）。

2.1 建立梯度洗脱方法 用10%～100%甲醇－水溶液，以流速0.5 ml/min冲洗色谱柱，直至基线稳定，按照2005版药典第一部方法对赤芍药材进行处理并作为样品溶液，每次进样10 μl。

在30 min内，进行由10%～30%甲醇－水线性梯度洗脱（流速1.0 ml/min），流动相中强洗脱剂甲醇以每分钟0.6%的梯度陡度进行洗脱。如图1所示。

图1 10%～30%甲醇-水线性梯度HPLC色谱图

图1中显示死时间tM＝1.0 min，样品中第一个峰与最后一个峰分的保留时间分别为ti＝1.105 min和tf＝23.366 min，此时末峰与首峰的保留时间差 Δtg为：Δtg＝tf-ti＝23.366 min-1.105 min＝22.261 min，梯度洗脱时间 tG为 30 min，依据 Δtg/tG的比值，来判定是否需要进行梯度洗脱。判断标准为[3]：Δtg/tG≤0.25，进行等度洗脱；Δtg/tG>0.25，进行梯度洗脱；在本分离中：Δtg/tG＝22.261/30＝0.742，由于 0.742>0.25，所以本次分离应进行梯度洗脱。

由图1可以看出，首次进行梯度洗脱所确定的梯度洗脱时间tG并不合适，因在色谱图中中部和结束存在时间上的浪费，经DAD光谱扫描5号色谱峰纯度不高，在219.4 nm和261.8 nm处各有1个强吸收峰，估计是没有得到完全分离。此时的梯度陡度T=ΔφA/tG=0.2/30=0.0067，需要减小此时的梯度陡度，以改善分离情况，见图2。

图2 5号光谱图

2.2 改变梯度洗脱条件 由图1中造成洗脱时间浪费的原因，是由于梯度洗脱中强溶剂A选择浓度A%变化范围太宽引起的，为此可缩小A浓度的变化范围，于是改用2次梯度洗脱的方法，在 0～10 min 内采用 φA：10%～20%，此时的梯度陡度 T=ΔφA/tG=0.1/10=0.01，以缩短 1、2、3 号 3 个峰的保留时间；10～30 min 20%～30%，此时的梯度陡度 T=ΔφA/tG=0.1/20=0.005，以改善色谱峰5的分离情况。按照设置条件进行第二次梯度洗脱，获得图谱如图3。

图3 20%～30%甲醇-水线性梯度HPLC色谱图

由图3可以看出1号色谱峰之前，应该还有色谱峰的出现；原来的5号色谱峰已经分离开6号，另外在4号峰前面又分离出8号峰，说明梯度条件的改善的确带动了色谱峰的分离，由于5、6号2个色谱峰没有彻底分开，所以要保持时间不变的情况下降低梯度陡度T，即0～10 min φA的比例变化为 15%～20%；10～30 min为 20%～35%，以改善色谱峰的分离。从而得到色谱图4。

由图4可以看出，色谱峰基本都已经得到分离，并且此时得到的色谱峰数目最多，此时的梯度陡度 T0～10=ΔφA/tG=0.05/10=0.005，T10～30=ΔφA/tG=0.15/20=0.0075。笔者按照此流动相梯度把进样时间提高到60 min未见有色谱峰的出现，确定赤芍药材的色谱峰已经分离完全。

图4 20%～35%甲醇-水线性梯度HPLC色谱图

3 讨 论

为获得理想的梯度洗脱分离效果和良好的重现性，必须在实验中注意以下问题：

3.1 检测波长的选择 本文中采用二级管阵列检测器对赤芍药材的三维图谱进行扫描，考察了257、260.5、263、265 nm，4个波段，综合出峰最多、分离情况最好、基线最稳定等因素选择了260.5 nm作为检测波长。考虑到赤芍药材自身的稳定性，所以在用赤芍药材进行梯度洗脱时还要考虑到赤芍成分的稳定性和重现性，在24 h以后赤芍中的有些成分的色谱峰面积出现下降的趋势，可能是药材中某些成分的不稳定导致。如果药材本身的稳定性差，更要优化好梯度的条件，以使药材成分在最短的时间内得到较好的分离。

3.2 色谱柱的平衡 每一次梯度洗脱分析结束时，流动相的组成已和梯度洗脱开始时大不相同，为了进行下一次的梯度洗脱，必须用起始浓度的梯度流动相平衡一下色谱柱，直至基线稳定。实验证明用起始流动相使色谱柱平衡周期足够长，才能获得重现性较好的色谱图。针对赤芍药材，每次进样结束以后都要进行一次较长时间的平衡色谱柱，才能在下次进样时得到重现性较好的图谱。如果色谱柱平衡的时间不够，在色谱图中早期洗脱峰的保留时间将会发生改变，而后洗脱谱峰的保留时间一般不受影响，当进行反相色谱梯度洗脱时，最好从5%或者超过5%的有机相开始，可缩短柱平衡的时间；若从纯水开始进行梯度洗脱，则色谱柱就需要较长的平衡时间。

3.3 空白梯度 当开始进行梯度洗脱前，要进行一次空白溶液的梯度洗脱，即不注入样品，仅按照梯度洗脱程序运行得到的基线。空白梯度实验于样品梯度洗脱程序完全相同的条件下进行，以确定所用的溶剂对色谱干扰程度，应尽量选择干扰比较小的空白溶剂，得到置信度较高的色谱信息。笔者对空白梯度的流动相进行考察，选用去离子水、双蒸水、超纯水三者对比进样，图谱显示使用超纯水进行梯度空白可有效减少基线干扰。

3.4 梯度开始时间的滞后问题 当确定了洗脱程序以后，从t＝0开始梯度洗脱实验操作，但由于实现梯度洗脱的仪器设备结构或者电子控制系统的多种原因，使实际观测到的梯度洗脱总是向后平移了一段时间，称为梯度系统的滞后时间。并且由于水和有机溶剂的混合不是在无限小的空间内完成的，而是在具有一定体积的梯度混合器内实现，并与脉动阻尼器和连接的体积有关，这些体积越大，梯度洗脱的线性就越差，这同时也是衡量HPLC系统梯度洗脱线性优劣的判定标准。

3.5 梯度方案的优化 在本文中以改变梯度陡度，根据实际情况改变洗脱时间，从而达到优化目的；也可以固定时间而通过改变梯度陡度达到洗脱的目的。如果在一个梯度洗脱中，聚集在色谱图中间部分的组成过于密集，未能实现理想的分离，此时也可以改变梯度洗脱程序曲线的形状，由一阶梯度洗脱变成二阶梯度洗脱，即在有2个梯度陡度的一阶梯度洗脱中间部分加入适当时间间隔的等度洗脱部分，这样就可以使色谱中间部分的组分色谱峰获得理想的分离效果。

[1]Jandera P,Churacek J.Gradient elution in column liquid chormatograghy[M].Theory and Practice,Amsterdam,Elsevier,1985.59-129.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典.2010年版一部[M].北京：化学工业出版社，2005.109.

[3]于世林.高效液相色谱方法及应用[M].北京：化学工业出版社，2005.122-140.