广东地区鸭黄病毒QS株的分离和初步鉴定

2012-10-09钟植文苏伟桐江鹏华周泽标刘镇明杨傲冰

中国兽药杂志 2012年7期

钟植文，苏伟桐，江鹏华，周泽标，刘镇明，杨傲冰

(1．广东永顺生物制药有限公司，广州 511356;2．华南农业大学兽医学院，广州 510642)

2010年4月以来，我国部分地区陆续发生一种新疾病，以产蛋鸭产蛋急剧下降，卵泡变性，卵泡膜出血为特征，目前有报道确定为由鸭黄病毒引起［1－3］。广东清远地区某商品蛋鸭场，6000只蛋鸭1周前开始出现减料降蛋。至2011年9月18日，产蛋量从原来每天4800枚降至2800枚，即产蛋率从80%降至46．7%，下降了33．3%;而饲料量从原来每天25包降至20包，即采食量从每只鸭每天167 g降至133 g，下降了20%。对病死鸭只进行解剖，病变主要为卵泡充血、出血(图1)。本文对广东清远地区某商品蛋鸭场该病进行诊断研究。

图1 病死鸭卵泡充血、出血

1 材料与方法

1．1 细菌分离无菌采取广东清远地区某商品蛋鸭场病(死)产蛋种鸭的肝脏、脾脏、心血等，接种于普通营养琼脂、麦康凯琼脂、鲜血液琼脂等培养基，置37℃温箱培养。

1．2 病毒分离和传代采取广东清远地区某商品蛋鸭场病(死)产蛋种鸭的肝脏、脾脏、肺、卵巢等内脏组织，按常规方法匀浆后，反复冻融3次，3500 r/min离心10 min，吸取上清液，加入青链霉素，终浓度均为1万单位/mL，4℃作用2 h，再经细菌滤器过滤除菌，保留滤液。滤液经尿囊腔途径接种9日龄鸭胚(由广东永顺生物制药有限公司提供)8只，每只0．3 mL。接种后置37℃温箱孵化，每天照胚4次，连续观察7 d。观察死亡鸭胚病变，收获死亡鸭胚尿囊液，无菌检查后命名为QS株，然后连续传代，同时开始进行鸡胚传代。

1．3 血凝试验参照文献［4］，配制1%鸭、鸡红细胞悬液，分别进行微量血凝试验。

1．4 PCR、RT－PCR鉴定和序列测定分析根据实验初步结果，分别针对鸭瘟病毒UL6基因，禽流感病毒M基因，禽副粘病毒Ⅰ型F基因，鸭肝炎病毒VP1基因和黄病毒属Tembusu病毒的非结构蛋白NS5基因设计引物，引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。其中，针对Tembusu病毒NS5基因设计的引物序列为P1:5’－GACACTAGAATAACCAAG －3’，P2:5’－GCGAATCTGTCATCTGCT－3’。用 Takara Universal Genomic DNA Extraction Kit提取接种QS株的鸭胚尿囊液的病毒总DNA，再用针对鸭瘟病毒UL6基因所设计的特异性引物进行PCR扩增。用Takara MiniBEST Viral RNA Extraction Kit提取接种QS株的鸭胚尿囊液的病毒总RNA，用随机引物为反转录引物合成cDNA，再分别用针对禽流感病毒M基因、禽副粘病毒Ⅰ型F基因，鸭肝炎病毒VP1基因和Tembusu病毒NS5基因所设计的特异性引物进行PCR扩增。另外，再用Takara MiniBESTViral RNA Extraction Kit提取健康鸭胚尿囊液的病毒总RNA，随机引物为反转录引物合成cDNA，针对Tembusu病毒NS5基因所设计的特异性引物进行PCR扩增，并作为对照，所有的PCR和RT－PCR产物一起电泳检测结果。将阳性产物经回收纯化后送英潍捷基(上海)贸易有限公司进行序列测定。用 BLAST(http://blast．ncbi．nlm．nih．gov/Blast．cgi)进行相似性检索，用CLUSTALW比较序列相似性，用MEGA 4．0构建系统进化树。

1．5病毒对鸭胚的ELD50测定参照文献［5］，将QS株第3代病毒液以灭菌生理盐水配制成10－5～10－1的病毒液，每个稀释度分别经尿囊腔途径接种8只9日龄鸭胚，每只0．2 mL。每天照胚4次，24 h内死亡胚弃去不计数，之后每天记录死胚情况，连续观察7 d，按Reed－Muench法计算病毒的ELD50。

2 结果

2．1 细菌分离病料接种的普通营养琼脂、麦康凯琼脂、鲜血液琼脂等培养基均无菌落生长，初步排除细菌感染的可能性。

2．2 病毒分离和传代经处理的病料接种9日龄鸭胚，孵化68 h开始出现死亡。死亡胚体全身出血，尤其是头、颈、脚出血明显(图2)。收获死亡鸭胚尿囊液，无菌检查为阴性。进行鸭胚传代，连续传9代。鸭胚的死亡率均为100%，死亡时间集中在68～96 h。取第3代鸭胚尿囊液，接种9日龄鸡胚，89 h开始出现死亡，死亡胚体严重出血，而死亡时间不集中，在89～143 h之间。初步确定为病毒性感染。

图2 接种QS株后的鸭胚

2．3 血凝试验每一代鸭胚尿囊液和鸡胚尿囊液均不能凝集鸭和鸡红细胞，表明QS株对鸭和鸡红细胞无血凝性。

图3 QS株病毒PCR和RT－PCR检测结果

2．4 PCR、RT－PCR鉴定和序列测定分析用针对黄病毒属Tembusu病毒NS5基因所设计的特异性引物进行RT－PCR扩增，结果显示扩增片段大小约为400 bp，而针对禽流感病毒M基因，禽副粘病毒Ⅰ型F基因，鸭肝炎病毒VP1基因和鸭瘟病毒UL6基因，所设计的特异性引物均未能扩增出任何预期片段(图3)。将目的条带回收纯化后，经测序后对获得序列进行分析，扩增片段为419 bp。用Blastn进行比较分析，发现与黄病毒属中的Tembusu病毒相似性最高，其中与Tembusu病毒Fengxian株相似性高达99%，而与黄病毒属其它毒株如YY5株、CJD05/CHN/2010株和SD/CHN/2010株相似性均达98%。基于NS5基因部分片段建立系统进化树，QS株和黄病毒属Fengxian株等多个毒株处于同一分支，而Tembusu病毒Sitiawan株等多个毒株处于另一分支(图4)，这些都表明QS株与Tembusu病毒亲缘关系很近，也属于黄病毒属。

2．5 病毒对鸭胚的ELD50测定 QS株的鸭胚尿囊液稀释后接种9日龄鸭胚，10－1和10－2稀释度的病毒液接种的8只鸭胚，死亡率均8/8，10－3稀释的病毒液接种的，死亡率为7/8，10－4稀释的病毒液接种的，死亡率为2/8，10－5稀释的病毒液接种的死亡率为0/8。按Reed－Muench法计算，QS株对鸭胚的ELD50为 10－3．6/0．2mL。