猪支原体肺炎活疫苗(168株)的安全性研究

刘茂军，苏国东，周勇岐，2，冯志新，王海燕，朱晓玮，2，邵国青

(1．江苏省农业科学院兽医研究所，农业部兽用生物制品工程技术重点实验室，国家兽用生物制品工程技术研究中心，南京 210014;2．南京天邦生物科技有限公司，南京 211102)

猪支原体肺炎(Mycoplasma Pneumoniae of Swine，MPS)又称猪地方性肺炎，该病是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)引起的一种猪慢性呼吸道传染病，在全世界养猪国家和地区普遍存在，给养殖业造成了严重危害［1－3］。疫苗预防是控制该病的主要手段［4］。猪肺炎支原体168株是江苏省农业科学院兽医研究所连续传代培育而成的适应无细胞培养基(KM2)的弱毒株。我们对该弱毒株的安全性进行了研究，确保该菌株疫苗的临床使用效果。

1 材料

1．1 疫苗、培养基和试剂 猪肺炎支原体168株(X+1)代(5×107CCU/mL)和3批次猪支原体肺炎活疫苗(168株)(X+15)代由江苏省农业科学院兽医研究所保存。5批次猪支原体肺炎活疫苗(168株)(X+15)代由南京天邦生物科技有限公司制造。猪肺炎支原体P46基因PCR引物由TaKaRa公司合成。KM2培养基和兔抗猪肺炎支原体J株高免血清由江苏省农业科学院兽医研究所制备。

1．2 试验猪 5～15日龄猪75头，仔猪和哺乳母猪均为猪肺炎支原体IHA抗体阴性，来源于江苏省农科院猪场，饲养于江苏省农科院试验动物房，各组猪隔离饲养，饲喂无抗生素的饲料，饮用自来水。120头商品猪来源于广东某猪场，一直饲养与该猪场。

2 方法

2．1 感染性试验 用猪肺炎支原体168株X代肺内注射接种5头5～15 d龄试验猪，每头1 mL，另5头不注射作为岗哨组。在注射疫苗前、注射后4 h以及注射后第1～4 d每日上午检测直肠温度;并于接种后连续逐日观察临床症状至剖杀前，主要观察观察是否有精神不振、食欲减退、呼吸困难、呕吐、俯卧、震颤等不良症状。在注射后第25 d剖杀所有猪，采集肺脏，检查是否存在组织病变。肺病变指数按照28分评分法判定［5］。

2．2 毒力返强试验

2．2．1 连续感染试验 用2 mL猪支原体肺炎活疫苗(168株)X代右侧肺内接种5头5～15日龄试验猪，隔离单圈饲养25 d后，剖检试验猪，观察肺脏是否有胰样小叶性肺炎病变，并以无菌操作分别从5头猪右侧肺脏剪取注射部位周围肺组织约5～7 g剪成细块，混合研磨成糊状，加入含有1000单位/mL青霉素的Hank’s溶液，配制成5%肺悬液，当日再肺内接种到第二批5～15日龄健康易感猪5头，2 mL/头。如此反复连续接种5代，观察每代次各接种猪临床症状和肺脏的病理变化。

2．2．2 菌株鉴定 每代次剖杀的猪肺用P46 PCR方法进行检测，对猪支原体肺炎活疫苗(168株)菌体和第5次回归猪的PCR扩增产物进行序列分析［6，7］。

2．3 不同免疫剂量安全性试验 3批次猪支原体肺炎活疫苗(168株)肺内接种健康猪进行一次单剂量、单剂量重复和一次大剂量接种各5头，分别注射1次1头份、间隔2周2次各注射1头份和1次10头份，每头份体积均为1 mL;对照组5头猪同时肺内接种1 mL生理盐水。各组在当日注射疫苗前、注射后4 h以及注射后第1～3 d的每日检测直肠温度，并于接种后连续逐日观察临床症状至剖杀前。接种后第25 d将试验猪全部剖杀，采集肺脏，对注射部位特别检查。

2．4 临床安全性试验 用5批次猪支原体肺炎活疫苗(168株)在猪场进行免疫，每批次免20头，1头份/头，对照20头不免疫。对免疫组和对照组的各猪只在免疫前、免后6 h和免后24 h抽样检测直肠体温，疫苗免疫后28 d内进行临床观察，观察是否有精神不振、食欲减退、呼吸困难、呕吐、俯卧、震颤等不良症状。

3 结果与分析

3．1 感染性试验结果

3．1．1 临床症状观察 仔猪注射猪支原体肺炎活疫苗(168株)后25 d内，试验组和岗哨组的猪均表现正常，均未观察到精神不振、食欲减退、咳嗽、呼吸困难、俯卧、呕吐、震颤、死亡等不良反应。提示猪支原体肺炎活疫苗(168株)对猪只的影响轻微，没有可观察到的临床症状发生。

3．1．2 注射后的体温变化 在所有测温的时间点，试验组猪的直肠温度平均值与对照组的相差范围在0．5℃以内。测得的每组平均直肠温度见图1。

3．1．3 大体病理观察 在注射后25 d进行剖检，试验组与岗哨组均未观察到猪支原体肺炎病变。提示该活疫苗免疫接种后未见眼观肺脏病变，也未引起同圈猪发生眼观肺脏病变。

图1 猪注射当日前后各时间的平均直肠温度

3．2 毒力返强试验

3．2．1 临床症状观察和肺脏剖检结果 猪支原体肺炎活疫苗(168株)进行肺内注射猪后，用肺脏悬液连续5次毒力返强接种试验猪的临床观察、肺脏剖检结果见表1。

表1 连续5代毒力返强试验猪肺脏临床症状、肺脏病变结果

猪支原体肺炎发病猪的典型症状表现为咳嗽、呼吸困难、气喘等［6］。由上表可见，猪支原体肺炎活疫苗(168株)肺内注射易感猪均表现正常，未观察到该病的临床症状。第2～5代连续返强试验接种时，接种猪也未见明显临床反应，病理剖检均未产生眼观典型的猪支原体肺炎病变。对每代连续返强试验接种的肺组织均可检出猪肺炎支原体，第5代返强试验猪扑杀的分离物经代谢抑制试验鉴定为猪肺炎支原体。连续5代返强试验的临床症状和大体剖检结果提示在5代次内该疫苗菌株毒力稳定，逐次传递没有返强迹象。

3．2．2 菌株分离和鉴定 用该活疫苗(168株)肺内注射后的肺脏悬液连续5次接种试验猪，逐次剖取各批次猪的肺脏接种于KM2培养基后均分离获得的疑似猪肺炎支原体菌体，经代谢抑制试验鉴定均与猪肺炎支原体J血清型一致，因猪肺炎支原体仅有一个血清型，所以分离到的菌株为猪肺炎支原体。再用猪肺炎支原体特异性P46引物进行PCR扩增，结果均扩增到了目的条带。对猪支原体肺炎活疫苗(168株)的菌液和从第5次猪肺分离的猪肺炎支原体的PCR扩增产物进行测序，序列分析结果显示两者序列完全一致。

3．3 不同免疫剂量安全性试验

3批次猪支原体肺炎活疫苗(168株)进行一次单剂量、单剂量重复和一次大剂量各接种5头健康猪的安全性试验。另对照组5头，各组在当日注射疫苗前、注射后4 h以及注射后第1～25 d的每日检测直肠温度，与对照组相比均未超过1℃(图2～图4)。注射后第1～25 d试验猪均表现正常，未观察到呼吸困难、俯卧、呕吐、食欲不振、震颤和死亡等临床症状。在注射后25 d进行剖检，试验组注射部位有白色斑痕，无猪支原体肺炎病变，对照组未观察到异常。

3．4 临床安全性试验

5批次疫苗免疫后28 d内临床观察，结果均表现正常，未见精神不振、食欲减退、呼吸困难、呕吐、俯卧、震颤等不良症状。免疫组和对照组的猪在进行抽样检测直肠体温(图5)，结果显示免疫组猪的直肠温度平均值与对照组的相差范围在0．5℃以内。

图2 猪支原体肺炎活疫苗(168株)一次单剂量免疫猪的平均直肠体温变化

4 讨论与结论

疫苗免疫是防控猪支原体肺炎病的最有效措施之一。目前市面上的猪支原体肺炎疫苗有国产的活疫苗和进口的灭活疫苗。其中灭活疫苗安全性和免疫效力均好，但其价格昂贵限制了广泛使用;活疫苗安全性好，免疫效力高，价格低廉，在国内正在替代灭活疫苗市场。而安全、有效和质量可控是疫苗研究的核心，其中又以安全性最为重要。因此，我们对猪支原体肺炎活疫苗(168株)的安全性从不同代次、疫苗的不同剂量安全性和临床应用等方面进行了试验观察。

5～15日龄是猪对猪肺炎支原体的易感期。同群感染性试验选用健康易感猪用高浓度的猪肺炎支原体(5×107CCU/mL)进行感染，结果显示免疫猪未观察到猪支原体肺炎的临床症状和大体病理变化，同时同群感染猪也未观察到异常症状和变化。五代次连续感染试验证实猪肺炎支原体168株试验猪均未观察到猪支原体肺炎的临床症状和病理变化。这两个试验证实制苗用菌株对猪安全，不会返强。大剂量和单剂量重复是对疫苗的又一严格的安全性评估，本研究中接种猪均未观察到异常临床表现，同时也未观察到肺部病变。同时，还用疫苗进行了临床应用结果也显示疫苗安全。上述结果都说明猪支原体肺炎活疫苗(168株)具有良好的安全性。

［1］ 赵德明，张仲秋，沈建忠译．猪病学［M］北京:中国农业大学出版社，9版，2008:795 －802．

［2］ Maes D，Segales J，Meyns T，et a l．Control of M ycoplasma hyopneumoniae infections in pigs［J］．Vet Microbiol，2008．126(4):297－309．

［3］ 沈青春，覃青松．猪肺炎支原体的研究进展［J］．中国兽药杂志，2003，6:26 －30．

［4］ 邵国青．猪喘气病的控制与净化方法的建议［J］．养猪，2010，6:65－69．

［5］ 金洪效，储静华，毛洪先，等．猪气喘病弱毒株免疫研究［J］．中国兽医科技，1989，1:3 －6．

［6］ 邵国青，刘茂军，孙佩元，等．猪气喘病实验猪模型的建立［J］．微生物与感染，2007，4:215 －218．

［7］ Futo S，Seto Y，M itsuse S，et a l．Molecu lar cloning of a 46－kilodalton surface antigen(P46)gene from Mycoplasma hyopneumoniae:directevidence of CGG codon usage for arginine［J］．Journal of Bacteriology，1995，177:1915 －1917．

［8］ 刘茂军，张 映，邵国青，等．猪支原体肺炎可疑肺组织PCR检测方法的建立［J］．山西农业大学学报(自然科学版)，2009，5:444－447．