高效液相色谱法检测多种动物组织中氟喹诺酮类药物残留量的研究

张玉洁，李 倩，汪 霞，王鹤佳，薛 毅，仲 锋

(1．中国兽医药品监察所，北京 100081;2．中国动物疫病预防控制中心，北京 100026)

氟喹诺酮类药物(FQs)自20世纪80年代初问世以来，相继被合成了许多广谱、高效、低毒的广谱杀菌性抗菌药，主要的药物有诺氟沙星、二氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星、达氟沙星等。它们的基本作用相似，对革兰氏阳性菌、阴性菌、支原体、某些厌氧菌均有效。本类药物的毒副作用小，安全范围较大。但本类药物对动物骨骼生长发育有不良影响，禁用于幼龄动物和孕畜，同时对胃肠道、中枢神经、肝细胞均有一定的危害［1］。随着氟喹诺酮类药物在兽医临床上的广泛应用以及耐药性的产生，FQs在可食性动物组织中的残留问题已引起人们的高度关注。

农业部第235号公告［2］对恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星、达氟沙星及二氟沙星在多种动物组织中的最高残留限量(MRL)进行了规定。而现在所用标准农业部第236号公告《动物性食品中恩诺沙星和环丙沙星残留检测方法—高效液相色谱法》［3］和农业部第1025号公告—14—2008《动物性食品中氟喹诺酮类药物残留检测高效液相色谱法》［4］在检测药物数量、动物品种及动物组织覆盖面方面均满足不了实际检测的要求。同时，沙拉沙星在鸡的肌肉组织中的最高残留限量为10μg/kg，上述两个标准的定量限也不能满足限量要求。因此，本研究在以上两个检测方法的基础上做进一步改进，增加了检测药物、动物品种及动物组织，降低了沙拉沙星定量限，以便更好地满足实际检测工作的需求。

1 材料与方法

1．1 仪器设备、试剂及对照品 Agilent 1100高效液相色谱仪(配荧光检测器);SPE柱:Bond Elut C18固相萃取柱(100 mg/1mL);固相萃取装置;pH计;高速冷冻离心机;Milli－Q超纯水仪。

环丙沙星、恩诺沙星、二氟沙星对照品，纯度≥99．0%，由中国兽医药品监察所提供;达氟沙星对照品，纯度99．8%，由Sigma－Aldrich公司提供;沙拉沙星对照品，纯度 95．0%，由Dr．Ehrenstorfer公司提供。甲醇、乙腈为色谱纯，磷酸、氢氧化钠、三乙胺、磷酸二氢钾、柠檬酸、乙酸铵均为分析纯。试验用水为符合国家标准的一级水。

1．2 溶液配制 5．0 mol/L氢氧化钠溶液:取氢氧化钠饱和液28 mL，加水稀释至100 mL，混匀。0．03 mol/L氢氧化钠溶液:取5．0 mol/L氢氧化钠液0．6 mL，加水稀释至 100 mL，混匀。0．05 mol/L磷酸/三乙胺溶液:取浓磷酸3．4 mL，用水稀释至1000 mL，用三乙胺调pH值至2．4。磷酸盐缓冲溶液(用于肌肉、脂肪组织):取磷酸二氢钾6．8 g，加水溶解并稀释至500mL，用5．0mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7．0。磷酸盐溶液(用于肝脏、肾脏组织):取磷酸二氢钾6．8 g，加水溶解并稀释至500mL，混匀。洗脱液:取乙腈20 mL，用0．05mol/L磷酸/三乙胺溶液稀释至100 mL，混匀。

5种FQs标准储备液:分别取达氟沙星对照品约10 mg，环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星和二氟沙星对照品各约50 mg，精密称定于50 mL量瓶中，用0．03 mol/L氢氧化钠溶液溶解并稀释成浓度为0．2 mg/mL(达氟沙星)和1 mg/mL(环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星)的标准储备液。置2～8℃冰箱中保存，有效期为3个月。5种FQs标准工作液:准确量取适量标准储备液，用乙腈稀释成达氟沙星(2μg/mL和0．2μg/mL)、环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星和二氟沙星(10μg/mL和1μg/mL)的标准工作液。置2～8℃冰箱中保存，有效期为1个月。

1．3 试验方法

1．3．1 液相色谱条件 色谱柱:C18250 mm×4．6 mm(i．d)，粒径 5 μm;流动相:0．05 mol/L磷酸/三乙胺溶液+乙腈(85+15，V/V)，使用前经微孔滤膜过滤(测肌肉、脂肪、肝脏组织用);柠檬酸/乙酸铵溶液+乙腈(85+15，V/V)，使用前经微孔滤膜过滤(测肾脏组织时用);流速:0．8 mL/min;检测波长:激发波长280 nm;发射波长450 nm;柱温30℃;进样量40μL。

1．3．2 标准曲线及线性范围的测定 准确量取适量FQs标准工作液，用流动相稀释成浓度分别为0．5、1、5、10、50、100 μg/L(以恩诺沙星为例)的对照溶液，供高效液相色谱分析。以各色谱峰峰面积为纵坐标，对照溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。1．3．3 样品前处理 取(2 ± 0．05)g试料，置50 mL离心管中，肌肉、脂肪试样加磷酸盐缓冲溶液10．0 mL，肝脏、肾脏试样加磷酸盐溶液 20．0 mL，涡旋混匀，中速振荡 5 min。10000 r/min离心10 min，取上清液于另一离心管中。肌肉、脂肪试样残渣中再加磷酸盐缓冲溶液10．0 mL;肝脏、肾脏试样残渣中再加磷酸盐溶液20．0 mL，重复提取一遍。合并两次上清液，充分混匀，备用。

取肾脏试样上清液10 mL于另一50 mL离心管中，加5 mL正己烷，中速振荡5 min。5000 r/min离心5 min，取下层清液，混匀，备用。

固相萃取柱依次用甲醇、水各2 mL预洗。取备用液3．0 mL过柱，超纯水1 mL淋洗，挤干。用洗脱液1．0 mL洗脱，挤干，收集洗脱液。经滤膜过滤后作为试样溶液，供高效液相色谱法测定。

1．3．4 检测限及定量限 分别取五种动物各自肌肉、脂肪、肝脏、肾脏4种组织的空白样品进行添加回收实验，按照上述样品前处理方法处理，进HPLC分析。以S/N≥10，且在该添加水平的回收率和变异系数均满足残留分析要求的最小浓度作为定量限(LOQ)，以S/N=3作为药物的检测限(LOD)。

1．3．5 准确度和精密度 采用标准添加法，在5种动物的肌肉、脂肪空白组织中添加3个不同浓度(5μg/kg、100μg/kg和200μg/kg)(以恩诺沙星为例)的FQs标准溶液进行回收率测定，每个浓度设定5个平行样品，同时进行空白试验，重复3次，求每个样品的回收率和批内、批间相对标准偏差(RSD)。按照相同方法，在5种动物的肝脏、肾脏空白组织中添加3个不同浓度(10μg/kg、100 μg/kg和200μg/kg)(以恩诺沙星为例)的FQs标准溶液，求每个样品的回收率和批内、批间RSD。

2 试验结果

2．1 标准曲线及线性范围 达氟沙星在0．1～20 μg/L浓度范围内，其他4种FQs药物在0．5～100 μg/L浓度范围内呈现良好的线性关系，其曲线方程和相关系数(R2)见表1所示。

表1 5种FQs药物的回归方程及相关系数

2．2 检测限及定量限 空白试料按1．3．3步骤处理后，测定结果表明:在相应的保留时间处，大部分空白试料对所测分析物无干扰;少部分空白组织在药物色谱峰保留时间处有较小干扰，可调整流动相比例避开干扰物质或者在回收率计算中减去空白。图1～图3给出了标准对照液、牛肾脏空白样品及组织添加样品的色谱图。

在猪、鸡、牛、羊、兔的肌肉、脂肪组织中添加5种FQs药物的标准溶液，使其在组织中的添加浓度分别为1、2．5 和 5 μg/kg(达氟沙星为 0．2、0．5和1μg/kg)。按照1．3．3提取净化方法处理后，经HPLC检测。测定结果显示，添加浓度为2．5μg/kg时，药物的信噪比(S/N)约等于3，添加浓度为5μg/kg时，信噪比均大于10，为此，确定环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星和二氟沙星在猪、鸡、牛、羊、兔的肌肉、脂肪组织中的检测限为2．5μg/kg，定量限为5μg/kg;达氟沙星的检测限为0．5μg/kg，定量限为1 μg/kg。

按与上述肌肉、脂肪组织相同的处理和分析，确定环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星和二氟沙星在猪、鸡、牛、羊、兔的肝脏、肾脏组织中的检测限为5μg/kg，定量限为10μg/kg;达氟沙星的检测限为1 μg/kg，定量限为2 μg/kg。

2．3 准确度和精密度 猪、鸡、牛、羊、兔各四种组织中三个浓度FQs药物添加回收试验的回收率、批内RSD和批间RSD结果见表2。

表2 5种FQs药物准确度及精密度试验数据(n=5)

由表2数据可知，该方法在五种动物共20种组织中的平均回收率为62% ～103%;批内变异系数为0．30% ～18%，批间变异系数为1．0% ～17%。方法准确度、精密度良好。

3 讨论

3．1 色谱条件的优化 由于在测定肾脏组织时杂质干扰较多，尤其是在牛的肾脏组织测定时，用原流动相 0．05 mol/L磷酸溶液/三乙胺 －乙腈(85∶15，V/V)，在被测物出峰时有较强的干扰，改变原流动相的比例也无法使其分离。因此在肾脏组织的提取过程中，增加了正己烷除脂的步骤，并用柠檬酸/乙酸铵溶液－乙腈(85∶15，V/V)作为流动相，试验结果显示(见图1－3)，经除脂和更换流动相后，在药物色谱峰保留时间处基本不再有较强的杂质峰干扰。最终确定在测定肾脏组织时，用柠檬酸/乙酸铵溶液 －乙腈(85∶15，V/V)作为流动相;在测定其它组织时，仍使用原流动相0．05mol/L磷酸溶液/三乙胺－乙腈(85∶15，V/V)。

3．2 提取条件的优化 农业部第236号公告《动物性食品中恩诺沙星和环丙沙星残留检测方法—高效液相色谱法》［3］和农业部第1025号公告—14—2008《动物性食品中氟喹诺酮类药物残留检测高效液相色谱法》［4］中对鸡肌肉、脂肪、肝脏、肾脏四种组织均用10 mL提取液提取两次，经对更多的动物组织的试验摸索，新方法对肝脏、肾脏组织采用了20 mL提取液提取两次，不仅对残留的药物提取得更充分，同时降低了单位体积提取液中的杂质量。

3．3 净化条件的优化 通过对200 mg/3 mL、500 mg/6 mL以及100 mg/1 mL等多种不同规格C18固相萃取柱的提取、净化实验，结果表明:规格大的C18固相萃取柱，虽然可过更多体积的提取液，进一步提高方法的灵敏度，但需要增加更多的有机溶剂和提取步骤，如氮吹或旋转蒸发等。而用原标准中的C18 100 mg/1 mL固相萃取柱，虽然方法灵敏度没有用大规格C18固相萃取柱高，但也足以满足235号公告中的限量要求。为此，该方法仍沿用吸附能力既能满足限量检测要求，同时又能充分洗脱的100 mg/1 mL C18固相萃取柱。

为了在满足方法定量限要求的前提下进一步简化操作步骤、减少杂质干扰，该试验取3．0 mL提取液过固相萃取柱。对比农业部公告第236号《动物性食品中恩诺沙星和环丙沙星残留检测方法—高效液相色谱法》中的“取适量备用液过柱”和农业部1025号公告—14—2008《动物性食品中氟喹诺酮类药物残留检测高效液相色谱法》中“取5．0 mL备用液过柱”，取3．0 mL提取液过柱不仅满足了定量限的要求，而且简化了操作步骤，更重要的是减少了组织中的杂质干扰，避免了固相萃取柱的堵塞，加快了净化步骤，也缩短了整个样品的前处理时间。

相对于现有标准方法，本方法提高了样品提取时的离心速度，其目的是尽量减少悬浮于提取液中的组织杂质，避免过固相萃取柱时造成柱子堵塞。这一改变在处理肝脏、肾脏时效果更加明显。

相对于其他三种组织，经磷酸盐溶液提取并将两次提取液合并后，肾脏组织的杂质干扰更多，不仅过SPE柱的过程更为困难，并且在环丙沙星出峰的保留时间处有明显干扰。因此，在20mL提取液合并后，取出10mL加入5mL正己烷除脂，振荡、离心后取下层清液过SPE柱。经此改进后，肾脏组织的前处理过程更为顺利，HPLC分析结果也显示杂质干扰大大减少。

综上所述，该方法操作简单，灵敏度高，准确度和精密度好，药物和动物组织覆盖范围广，可以很好地满足实际检测工作的需要。

［1］ 李俊锁，邱月明，王 超．兽药残留分析［M］．上海:上海科学技术出版社，2O02:257－262．

［2］ 中华人民共和国农业部公告第235号《动物性食品中兽药最高残留限量》［Z］．2002．

［3］ 中华人民共和国农业部公告第236号《动物性食品中恩诺沙星和环丙沙星残留检测方法—高效液相色谱法》［Z］．2003．

［4］ 中华人民共和国农业部公告1025号—14—2008《动物性食品中氟喹诺酮类药物残留检测高效液相色谱法》［Z］．2008．