蜜蜂采蜜期间链霉素和土霉素休药期的初步研究

柴 燕，赵新宇，周 杰

(南汇出入境检验检疫局，上海 201300)

蜂蜜是我国传统出口商品，并在世界上享有盛誉，但是我国蜂产品出口隐患并不少，蜂产品的质量安全也倍受关注，其抗生素残留控制已成为各国食品安全工作的重要部分之一［1］。在养蜂业中抗生素是用来防治蜜蜂细菌病的常用药物，而近些年来，药物残留问题严重影响了我国的蜂产品出口贸易［2－4］。欧盟、美国、日本等进口国对蜂蜜中的兽药残留提出了严格的限量要求，这使我国蜂蜜出口一度受阻，下降到历史最低点［5－6］。如何做到科学养蜂、合理用药已刻不容缓［7－9］。本实验通过对蜂群分别施用链霉素和土霉素后连续跟踪采样进行药残含量检测，进行分析得出两种药物残留在蜂产品中的休药期，以指导蜂农合理用药［10－11］。

1 材料与方法

1．1 材料 盐酸土霉素(98．5%)，美国Sigma公司;硫酸链霉素(99．0%)，美国 Sigma公司;土霉素、链霉素酶联免疫试剂，德国R－Biopharm公司。

1．2 仪器与设备 台式高速冷冻离心机，Thermo Scientific公司;多功能酶标检测仪及其软件SynergyTM，Bio－Tek公司;HP－5016SY氮气吹干仪，上海济成分析仪器有限公司。

1．3 方法

1．3．1 样品的准备

1．3．1．1 选群 选择群势强且相当的4箱蜂作为试验用蜂群，并准确定群。每种药物用2箱蜂，做平行对照试验。

1．3．1．2 给药 在花期前1周，按每10足框蜂加链霉素、土霉素各600 mg，分3次饲喂，每次200 mg，隔2 d给药一次。

1．3．1．3 采样与保存 在第3次给药后，每3天采样一次，连续10次;然后每5天采样一次，连续6次。每次作好标签，置于4℃冰箱内保存待测。采集样品时，取第1样与第2样应对取样桶、器具进行清洗。

1．3．2 标准曲线的制作 根据试剂盒说明，将试剂盒中链霉素、土霉素各标准品溶液分别稀释6倍，测定不同浓度标准品对抗体的抑制率，以相对吸光度B/B0(各相应浓度的药物抑制时的OD450nm值为B值，不加药物抑制时的OD450nm值为B0)为纵坐标，以不同标准品浓度的对数值为横坐标，绘制标准曲线，并推导出回归方程，进行相关回归分析。

1．3．3 前处理方法 含链霉素蜂蜜的前处理方法:准确称取1．0 g蜂蜜样品，加入9 mL提取缓冲液，室温下混合10 min。将此溶液以3000 g离心10 min。用RIDA C18柱纯化提取物:以2 mL甲醇(100%)和2mL蒸馏水洗涤柱子，流速为1滴/s;取样品上清液过柱，10滴/min;再以3 mL蒸馏水洗柱，正压去除残留液体并且用空气或氮气吹2分钟干燥柱子;用2 mL甲醇(100%)洗脱样品，流速为10滴/min;在40～50℃用弱空气或氮气流完全挥发溶剂;用10 mL PBS缓冲液溶解干燥的残留物，即10倍稀释，待用。

含土霉素蜂蜜的前处理方法:用80 mL的带盖玻璃瓶准确称取1．0 g蜂蜜样品，用PBS缓冲液(pH 7．4，20 mM)稀释 20倍。将此溶液超声 5 min，然后置于涡旋混匀器上快速混合5 min，待用。检测前将玻璃瓶上下颠倒混匀。

1．3．4 试剂盒加标回收率试验 精确配制4．0 mg/mL的土霉素和链霉素溶液，取一定体积标准品溶液添加至阴性样品，使样品的药物含量分别为40、20、2 ng/g，每个浓度的样品作两次平行提取后分别进行检测，计算回收率。

1．3．5 试剂盒精密度试验 在空白样品中加入适量标准溶液，按试剂盒提供的方法样品预处理后进行检测。同一天内每个浓度重复5个样，取平均值，计算日内变异系数。

1．3．6 样品的检测 检测前，首先将所有的试剂必须恢复到室温23～27℃，任何不用的试剂须立即放入2～8℃保存。将采集的样品按照步骤1．3．3方法相应的进行前处理。全部处理完后，按照试剂盒方法说明进行检测，分析土霉素、链霉素两种药物的休药期。

2 结果与分析

2．1 样品的采集 按照步骤1．3．1．2的方法对蜂群给药，在第3次给药后次天进行采样，每个蜂群采集到16个样品，4个蜂箱共采集了64个样品。采样期间，天气适宜时群蜂以正常方式饲喂，遇有阴雨天时以糖水饲喂。样品编号以药物+箱号+采样日期表示，如:ST/OT 01 110416(ST是Streptomycin链霉素缩写，OT是Oxytetracycline土霉素缩写)，即为2011年4月16日采集的链霉素/土霉素1号蜂箱样品。

2．2 标准曲线的制作 按照1．3．2中的操作，将试剂盒药物标准品稀释，分别得到链霉素系列标准溶液(0．5、1．5、4．5、13．5、40．5 ng/mL)和土霉素系列标准溶液(1．5、4．5、13．5、40．5、121．5 ng/mL)系列，进行ELISA测定，所测的OD450nm随着药物标准物浓度的减小不断增大，在检测范围内相对吸光值(B/B0)与药物浓度的对数值呈线性关系，进行回归分析，两个药物酶免疫试剂盒的线性关系良好。结果见图1、图2。

2．3 加标回收率试验 准确称取4份1．0 g阴性蜂蜜样品(每种药物各2份样品)，分别添加40、20、2 ng链霉素和土霉素，样品按照步骤1．3．3进行前处理，检测结果见表1。经检测，链霉素、土霉素平均加标回收率分别是92．7%、85．6%，与试剂盒说明书一致。

图1 ELISA方法检测链霉素的标准曲线

图2 ELISA方法检测土霉素的标准曲线图

表1 链霉素和土霉素加标回收试验结果

2．4 精密度试验 量取适量的链霉素、土霉素标准溶液，分别添加到1．0 g阴性蜂蜜样品中，使其终浓度分别是40、10、2 ng/mL，每个浓度重复检测5次，计算变异系数，结果见表2。由表2可知链霉素、土霉素试剂盒的变异系数分别是 4．95%、6．39%，重复性好。

表2 链霉素和土霉素ELISA试剂盒变异系数试验

2．5 样品的检测 按照1．3．5方法对采集的64个样品进行药物浓度的测定，结果见表3。表中的采样时间是指给药后的天数，如编号ST/OT 01/02 110428的样品是指在给药后第13天采集的样品。

表3 样品中药物浓度的检测结果

3 讨论

土霉素是四环素族药物，是一种广谱抗生素，蜂农常用它防治蜜蜂幼虫感染的腐臭病，因此可能会导致蜂产品中四环素族抗生素残留。由于四环素族抗生素会在人体内富集，从而危害身体健康。链霉素是一种氨基糖苷类抗生素，主要毒性反应为对第八对脑神经的损害，引起耳鸣，头昏，眩晕等，若使用量较大可导致听力减退，重听，甚至有耳聋的可能。

日本是我国蜂蜜出口的主要国家，日本对我国蜂蜜等产品的质量要求越来越严格，尤其是2005年11月29日，日本厚生省在日本政府网站上发布了对日本进口所有食品制订的新控制标准，也就是在2006年6月1日起正式实施的表格，即日本“肯定列表制度”［13］。我国有关部门也非常重视兽药残留，2003年我国农业部和国家质检总局为解决蜂产品中兽药及违禁药物残留问题联合组织开展了蜂产品兽药残留专项整治工作。为加强兽药残留监控工作，保证蜂产品出口安全，于2007年7月9日第二十次修订了出口食品安全卫生检测监控项目，规定了蜂产品中一些药物的最高残留限量［14］。

根据日本肯定列表规定，出口日本蜂蜜中的四环素族抗生素残留总量小于300μg/kg。根据国质检食函［2006］308号文，出口日本蜂蜜中链霉素残留限量不得高于 10 μg/kg［13－14］。而欧盟法规(EEC)NO．2377/90及修订指令要求，蜂蜜中土霉素检测限量是10μg/kg。由表2可知，链霉素在给药33 d后其蜂蜜中的残留量为5．67μg/kg，土霉素在用药后43 d残留量为7．77μg/kg，已经符合欧盟、日本及美国等进口方最严要求(低于10μg/kg)。因此，蜂农在采蜜期前45 d内切忌使用抗生素类药物。同时，在使用相同剂量情况下，蜂蜜中的链霉素残留量要明显低于土霉素，其在蜜蜂体内的消除速度也比土霉素要快。此外，为避免产生耐药性，建议对四环素族类和氨基糖苷类族内抗生素交替使用。

目前国内企业的出口蜂蜜质量控制项目中关键的问题是质劣和抗生素的超限问题，而抗生素的超限又是表现得最多的问题［15］。因此，加强源头管理，提高蜂蜜质量，研发先进检测技术，对我国蜂蜜产品出口而言是一件重要而且有意义的事情［16］。

［1］ 李春杰，姚 宇．中国蜂产品出口国际竞争力比较分析［J］．云南财经大学学报，2007，22(2):21－23．

［2］ 中国养蜂学会．欧盟禁我蜂蜜已波及英国、日本、美国和加拿大等国家［J］．中国养蜂，2002，53(3):31．

［3］ 刘进祖，张永贵．浅析中国蜂产品出口遭“零标准”氯霉素封杀及其应对措施［J］．中国养蜂，2003，54(3):39－40．

［4］ 陈振起．日本对进口蜂蜜新的列表制度对我国养蜂业的影响［J］．蜜蜂杂志，2006，(4):23－24．

［5］ Kennedy D G，Andrew C，Robert JM．Regulatory problems caused by contamination，a frequently over looked cause of veterinary drug residues［J］．Journal Chromatography A，2000，(882):37－52．

［6］ Bell T A．Antimicrobial susceptibility data and new animal drug approval in the United States:a historical overview［J］．Agriculture，2001，196:245－251．

［7］ 赵树荣，陈廷珠，李树军．控制药物残留，促进蜂业发展［J］．中国蜂业，2006，(5):39－41．

［8］ 陶柏成，胡智明．出口蜂户品源头管理模式探讨［J］．中国蜂业，2006，11:11－12．

［9］ 唐林林．蜂群用药对蜂蜜中药物残留影响的研究［D］．福建农林大学硕士学位论文，2008．

［10］任 琴．蜂王浆中药物残留来源确定及在蜂群中消除规律研究［D］．福建农林大学硕士学位论文，2008．

［11］庞国芳，张进杰，曹彦忠，等．GB/T 18932．23－2003蜂蜜中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定方法液相色谱－串联质谱法［M］．北京，中国标准出版社，2003．

［12］李 熠，韩胜明，黄京平．氟氯苯氰菊酯条蜂场休药期规定的验证研究［J］．中国蜂业，2007，58(4):7－9．

［13］中国技术性贸易措施网中关于“日本肯定列表”的相关中文网站［DB/OL］．http://www．tbt－ sps．gov．cn/jpmrl/Pages/default．aspx．

［14］进出口食品安全卫生检测监控项目一览表(2007年7月9日第二十次修订)［DB/OL］．http://www．ziq．gov．cn/portal/webfiles/web/file/11839652429858819．doc．

［15］冯 峰．蜂蜜中抗生素残留超标的原因剖析及其控制对策［J］．蜜蜂杂志，2002，10:21－22．

［16］张启明，李位三．防止蜜蜂“药残”超标的综合配套措施［J］．蜜蜂杂志，2005，11:33－34．