2006－2010年中国鼠伤寒沙门菌分子分型分析＊

陈建才，樊粉霞，王淑京，娄 静，刁保卫，阚 飙，赵英伟，闫梅英

鼠伤寒沙门菌经常引起人类胃肠炎或食物中毒，是常见食源性病原菌之一。随着生产生活模式的改变，国家之间和地域之间人员、食品往来、物资流通更加广泛，每年世界范围包括我们国家在内都会有沙门菌引起的食物中毒事件的报道，特别在欧美等发达国家，沙门菌污染食品致腹泻暴发由以前的点源性集中暴发，越来越多地转变为跨地区、跨州（省）的‘散在暴发’形式出现，使污染源及传播途经的发现越来越依赖于分子分型手段的辅助及确认［1－3］。对于鼠伤寒沙门菌，目前已有比较成熟的国际通用标准化 PFGE（Pulse－Field Gel Electrophoresis，脉冲场凝胶电泳）分型方案及第二代分子分型技术 MLVA（Multiple Loci VNTR Analysis，多位点串联重复序列分析），并成功应用于多起食源性疾病暴发特别是以实验室为基础的暴发的发现及溯源调查、确认［4－5］。

在我国，鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌是临床最常见的沙门菌致病血清型［6－8］。由这两种致病菌引起的集中点源暴发由于有清楚的流行病学背景资料，很容易识别，PFGE仅作为后续的补充确认手段，在我国是否存在类似发达国家的由散在病例构成的暴发尚需进一步证实。而这种暴发需要实验室及时的PFGE或MLVA分型分析，为提升我国实验室能力，建立以实验室为基础的监测，完善我国分子分型网络数据库，本研究对近5年我国不同省份来源的294株鼠伤寒沙门菌，进行PFGE及MLVA分型分析，初步建立我国鼠伤寒沙门菌分子分型数据库，了解其分子遗传特征，为该菌可能引起的暴发发现提供本底发病水平。

1 材料与方法

1．1 菌株来源 鼠伤寒沙门菌共294株，其中来源于2006年至2010年北京、上海、四川、广东、河南、湖北、重庆7省（直辖市）CDC沙门菌监测项目中收集的272株病人菌株，13株来源于食物皮蛋，5株来源于其他食品，2株来源于体检人群，来源于污水和鸭粪各1株。

1．2 PFGE分型 所有鼠伤寒沙门菌参照国际实验室分子分型监测网络PulseNet中沙门菌PFGE分型标准化方案进行操作。使用限制性内切酶XbaⅠ进行酶切，获得的菌株PFGE图像录入BioNumerics（Version5．1，Applied maths，Inc．）软件包进行处理，经校准后，使用非加权配对算术平均法（unweighted pair group average method，UPGMA）进行聚类，构建聚类树，分析菌株间的相似性。

1．3 MLVA分型 参照国际实验室分子分型监测网络PulseNet公布的鼠伤寒沙门菌MLVA分型标准方案，采用7个VNTR位点，合成相应引物（表1），并在引物5′端标记荧光基团，对294株鼠伤寒沙门菌进行PCR扩增，扩增产物使用ABI3700测序仪进行毛细管电泳检测，根据扩增片段大小计算每个VNTR位点的重复数。并将数据录入BioNumerics软件包进行分析。构建MLVA分型结果的最小生成树（minimum spanning tree，MST），构建参数为creation of complex：1changes。

2 结 果

2．1 鼠伤寒沙门菌PFGE分子分型特征 294株鼠伤寒沙门菌经XbaⅠ酶切，PFGE分析后，获得87种带型，分型的D值为0．905 0，每种带型包含176株菌株（图1）。3株（含）以上带型有13种，带型频率分布见表2。其中优势带型JPXX01．CN0001 76株，主要包括重庆8株、四川67株、河南1株，分别来自不同年代的腹泻病人粪便73株、皮蛋中分离13株；次优势带型JPXX01．CN0006 40株，分布于广东、河南、上海、四川、湖北；24株第3优势带型JPXX01．CN0073型，除2株来源于湖北外，其余皆为河南菌株。此外，来自河南的135株菌中54株和北京2009年的9株各自明显聚集成一簇（图1中虚线框所示），提示菌株具有一定的地域聚集性，但其他地区来源的菌株则未发现此现象。

2．2 鼠伤寒沙门菌MLVA分型特点 应用7个VNTR位点的MLVA进行分析，获得198种型别（图2），平均每种带型包含1．5株菌。3株（含）以上带型有19种，其中优势带型18 513株，均分离自河南2009年的患者菌株；其次优势带型03 312株，主要为2008年河南病人菌株；再次优势带型为05 311株，均来自四川2008年，包括7株皮蛋分离菌株，4株病人粪便中分离菌株。

利用软件BioNumerics对MLVA分型结果进行最小生成树分析，最小生成树根据所有VNTRs位点谱号构成生成，最小生成树将所有的MLVA型分为两群（图2）：A群和B群。A群包括152个MLVA型，其中75个型别亲缘关系较近，形成一簇，构成A群中较大的亚群，主要包括四川腹泻病人和皮蛋分离株，其次还有河南病人分离株，其他型别相对亲缘关系较远，与菌株来源的散在性相符。

图1 294株鼠伤寒沙门菌XbaⅠ酶切PFGE分型结果Fig．1 The PFGE patter n with XbaⅠdigestion within 294 S．typhimurium strains

图2 294株鼠伤寒沙门菌的MLVA分型结果Fig．2 MLVA molecular typing of 294 S．typhi murium isolatesSizes of circles and arcs reflect numbers of isolates．The pattern codes of MLVA are labeled in the circles．The relationships of 294 S．typhi murium isolates are labeled by different colours．

B群分为4个亚群，包括46个MLVA型。B群菌株主要为河南分离株，占74．12%，与PFGE聚类结果一致。

2．3 PFGE与MLVA分型的相互对照和相关联系2．3．1 PFGE－XbaⅠ单酶切分型方法对鼠伤寒沙门菌的分辨能力不及MLVA分型方法 294株鼠伤寒沙门菌PFGE－XbaⅠ分型的D值为0．9050。MLVA分型的D值为0．992 9，分辨能力高于PFGE，这与 Mia T等的报道一致［2］。除ST3位点 D值为0．221 6，其他VNTR位点均具有较高的多态性，D 值 分 别 为 0．638 8（ST2）、0．821 0（ST5）、0．837 7（ST6）、0．605 6（ST7）、0．626 2（ST8）、0．767 8（STTR10）。

2．3．2 MLVA分型方法的分型能力与两种酶切的PFGE几乎相同；MLVA分型方法更有利于聚集性事件的判定 294株鼠伤寒沙门菌经PFGE－XbaⅠ分析后，获得87种带型，对其中的主要优势带型JPXX01．CN0001菌株76株、JPXX01．CN0006菌株40株和JPXX01．CN0073菌株24株进一步用第2种内切酶Bl nⅠ酶切后，分别获得10、22和17种带型。其中优势带型JPXX01．CN0001 76株，进一步利用Bl nⅠ酶切（PFGE－Bl nⅠ），获得10种带型（表3），JPXA26．CN0029为优势带型，包含39株菌。其次为包含13株的JPXA26．CN0035型。MLVA将这76株菌分为44个型，其中9株053型、4株051型和5株043型均对应于PFGE－Bl nⅠ的部分JPXA26．CN0029型及分别对应于部分JPXA26．CN0035、部分JPXA26．CN0074和部分JPXA26．CN0033型；从表2不难看出，除JPXA26．CN0035型、JPXA26．CN0033和JPXA26．CN0074与MLVA分型基本一致外，其他PFGE－Bl nⅠ菌株进一步被MLVA区分为不同型别。当然，也有例外，如JPXA26．CN0029和JPXA26．CN0035则被归为同一个 MLVA 053型别，共9株，均来自四川同一沙门菌监测网点，分离时间为2008年，具有一定时间地域聚集性，其中属于同一型别的7株来自食物皮蛋中毒，联系流行病学资料，进一步证实了两种分型方法的一致性和可靠性。

2．3．3 PFGE可能提示菌株来源于往年暴发，MLVA更能揭示细菌基因组间的差异 294株鼠伤寒沙门菌经PFGE－XbaⅠ分析后，对其中3株（不含）以上的相同带型进一步用第2种内切酶Bl nⅠ酶切后，即PFGE－XbaⅠ－Bl nⅠ双酶切分型。分型条带总共有159型，D值为0．976 6，接近 MLVA分型区分水平，进一步说明前面所述。统计分型，经过2种酶切后，3株（不含）以上条带相同的有11个带型，见图3（横坐标为PFGE－XbaⅠ－Bl nⅠ双酶切带型与来源地区，纵坐标为菌株数）。从图3中不难看出，重 庆、四 川 地 区 JPXX01．CN0001－JPXA26．CN0029即0001－0029（ChongQing）和0001－0029（Si－Chuan），重庆可能为局限性暴发，四川2007－2009年都有相同PFGE带型出现，且2008和2009年均比2007年出现菌株数要多，呈现时间地域聚集，后两年的菌株聚类现象，可能是2007年延续至2009年，散发菌株引起的沙门菌病暴发。MLVA更能揭示细菌基因组间的差异。比如0070－0120（BeiJing）归属同一个PFGE带型，结合流行病资料，菌株来自同一时间地区的暴发；而MLVA分型却显示相似性比较高的8种型别，揭示了菌株基因组间的可变位点的微小差别，比PFGE分型更加精细。综上所述，在流行病学上，MLVA分型方法的分型能力与双酶切的PFGE分型相似，考虑到MLVA在操作上较PFGE更方便快捷的特点，故在判断由鼠伤寒沙门菌引起的聚集性事件时，采用需时较短、操作更方便的MLVA分型方法较两种内切酶的PFGE分型更有利于及时监测潜在或散在病例形式的疾病暴发。

图3 3株（不含）以上相同PFGE－XbaⅠ－BlnⅠ双酶切带型分布Fig．3 The distribution of the same PFGE－XbaⅠ－BlnⅠdouble enzyme digestion patterns

表1 实验用VNTR位点及其引物Tab．1 The applied VNTR loci and the corresponding primers

表2 鼠伤寒沙门菌PFGE－XbaⅠ带型频率分布Tab．2 PFGE－XbaⅠpattern frequency of S．typhimurium

表3 部分鼠伤寒沙门菌分子分型结果及其相对一致性Tab．3 Molecular typing and their compatibility within some S．tphimurium isolates

3 讨 论

全球化及食品贸易国际化带来的食品分发途径的改变，使食源性疾病发生逐渐由暴发转为多点散发，单纯血清型的分型鉴定已不能满足在复杂的食源性疾病诊断中对病原体进行溯源的需求。鼠伤寒沙门菌是非伤寒沙门菌性腹泻或食物中毒中最常见的血清型之一，经常被用于小鼠感染模型模拟人类伤寒发病过程或致病机理研究，由其引起的暴发几乎每年都有报道［1－8］。同时由于鼠伤寒沙门菌广泛存在于外界环境中，形成一定的环境、动物、动物性食品带菌状态及带菌率，人食用一定数量的病原菌后导致疾病，如何判定暴发病例感染的鼠伤寒沙门菌与食物及环境中的鼠伤寒沙门菌为一个克隆来源，需要相对精确地分子分型手段辅助，及对鼠伤寒沙门菌在人群中的本底发病水平的了解。随着分子生物学技术的不断发展，从DNA水平对致病菌进行分型及鉴定的技术也日趋成熟。

沙门菌监测必须通过细致的流行病学调查以及对病原体的监测分析才能揭示内在的联系，当前的传染病控制中，对病原体不仅仅局限于检测，而是要成为监测的重要内容，形成网络化，并结合流行病学信息。自1996年发展至今，食源性疾病分子分型网络已将细菌染色体DNA大片段的长度多态性分析、PFGE、计算机技术3者有机结合，是高技术、标准化、网络化、能够资源共享的网络。PFGE作为大多数细菌分子分型的金标准在暴发的发现及确认中得到了广泛的关注及应用。实验室网络工作人员依据已经完成的鼠伤寒沙门菌PFGE图谱，进行聚类分析，并与以往本底资料比较，发现新的聚集性PFGE图谱，或与往年同时期发病水平比较发现2倍（含2倍）以上增高时，通知流行病学人员进行现场调查分析，追踪可疑食品，并获得相同PFGE带型的食品来源菌株，最终确认暴发。因此，沙门菌引起的食源性疾病的暴发在很大程度上依赖于分子分型。分子分型区分能力是指分辨两种没有关联的亚型的能力。实验中采用Si mpso m指数的D值计算方法，它可以用于评价两种或多种分型方法对菌株分型能力的高低。应用该指数也可以评价区分散发的菌株与暴发的菌株来源的分辨能力［10］，D值取值范围为0～1，D值越大说明该分型方法的分辨力越高。多数食源性病原菌已有标准化PFGE操作方案，但对于血清型别复杂的沙门菌来说，使用一种PFGE方法存在一定的局限性，如PFGE很难区分不同来源的肠炎沙门菌，鼠伤寒沙门菌单独使用一种限制性内切酶（XbaⅠ）在判定菌株聚集性时可靠性较差，最好同时使用两种酶切（XbaⅠ与Bl nⅠ）。但采用双酶切时，不仅导致试验时间延长，而且增加试验成本。加之PFGE需要特定的试剂、仪器设备、软件及操作熟练的技术人员，这些都在一定程度上制约了PFGE的广泛推广。由于上述问题，MLVA作为第二代分子分型技术，以其操作方便、快捷、易检测的特点显示出一定的优势。对于鼠伤寒沙门菌，我们的结果显示MLVA的区分能力明显高于单酶切PFGE，与双酶切PFGE几乎相同，且两种分型结果存在一致性，进一步验证了MLVA分型方法的适用性及可靠性。

为完善我国沙门菌分子分型网络数据库，建立可用于暴发识别的基本资料，本研究利用PFGE和MLVA，同时对我国294株分离自病人及皮蛋的鼠伤寒沙门菌进行分子分型分析。结果显示PFGEXbaⅠ单酶切后的优势带型JPXX01．CN0001占25．8%，分离自2007－2009年，且主要集中于四川及重庆。次优势带型JPXX01．CN0006（占13．6%）为我国特有PFGE带型（通过国际Pulse Net数据库比对），虽然首次在广东发现该菌型异常增高，但通过加强监测及其他省市菌株PFGE分析发现，该型别在河南省2007年即存在，且双酶切带型一致，菌株分离时间相近（一个月内），提示可能存在暴发，但由于PFGE分型的延迟，未能及时开展污染源及传播途径的流行病学调查。同样，对于JPXX01．CN0073型，也存在类似的情况，也未能及时开展流行病学调查。这些均提示实验室应加强菌株分子分型的及时性。另一方面，这些型别的持续存在也说明污染源的持续存在，应加强监测及数据的及时分析，防止可能的大规模跨区域暴发。

此外，由于缺少详细的流行病学调查数据，有些菌株缺少具体的暴发地点、来源、分离时间。当实验室数据显示有聚集性时，由于缺少足够的现场证据，不能做出客观的结论。如图3中重庆、四川出现相同的 PFGE 双 酶切带型0001－0029（XbaⅠ －Bl nⅠ），分子分型呈现菌株聚集性，由于流行病学证据不足，缺少说服力；可能是2007年延续到2010年散发或者散发引起的暴发，对进一步追溯传染源有一定困难。可见，在传染病疫情发生时，搞好流行病现场调查，对预防和控制疫情显得尤为重要，并为今后的疫情防控提供借鉴。否则，实验室分子分型网络，只是理论研究。流行病学调查与实验菌株分析的有效结合，是现在传染病预防控制的模式，而且新传染病的发现也越来越多地依靠实验室数据。因此在我国，应加强流行病学调查与实验室的沟通，流行病学调查与实验室检测同步并行，才能在食源性疾病暴发的早期发现、早期干预方面有所突破。

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