弓形虫与疟原虫入侵引起宿主细胞骨架重组相关GTP酶不同定位的观察＊

陈艾媛，娜仁花，彭鸿娟，赵 亚

弓形虫（Toxopl asma gondii）和疟原虫（Pl asmodiu m spp）的分类地位均属于顶复门（Phyl u m Apico mplexa），孢子纲（Class Sporozoea），真球虫目（Or der Eucoccidiida）［1］。顶复门原虫都是通过与其质膜相连的肌动蛋白－肌球蛋白马达，以主动入侵的方式侵入宿主细胞内，而不是被宿主细胞所摄取或吞噬［2］。两种原虫都以纳虫泡的形式在宿主细胞内寄生并增殖，但是弓形虫、疟原虫与宿主细胞之间的相互作用大部分并不十分清楚，两者入侵细胞及纳虫泡膜形成的过程也各有不同的特点。

细菌、病毒等病原入侵宿主细胞后都伴随有宿主细胞骨架重组的过程［3］。顶复门的原虫包括隐孢子虫（Cr yptosporidiu m par vu m）、弓形虫、疟原虫入侵宿主细胞后都有引发宿主细胞骨架重组的现象：隐孢子虫感染宿主细胞时诱导宿主肌动蛋白网络形成片状结构，将虫体与宿主细胞质分隔开来，从而形成一个细胞内胞质外的小室，并在小室中进行增殖［4］；弓形虫速殖子和伯氏疟原虫裂殖子入侵宿主细胞后在“运动连接（moving j unction）”处形成一个宿主细胞F－肌动蛋白环，因而推测弓形虫与疟原虫的入侵过程需要宿主细胞肌动蛋白的极化［2］；弓形虫的入侵激活宿主细胞微管和微丝等细胞骨架元件的重组［5］，而在感染的晚期，弓形虫启用宿主细胞的微管形成管道结构将宿主细胞器组分运输到纳虫泡膜上［6］；疟原虫感染红细胞后，向红细胞的胞质中分泌虫体蛋白，调控红细胞骨架的重组［7－9］。

Rho GTP酶属于Ras超家族的成员，其分子量一般在20～30 k D。Ras家族成员众多，在哺乳动物中至少由14个亚族组成，其中最具代表性的为Rho（Ras ho mologous member）、Rac （ras－related C3 bot ulinu m toxin sub－strate）和 Cdc42 （cell division cycle 42）3个亚族。Rho GTP酶广泛地调节细胞功能，许多调节是通过控制肌动蛋白极性来实现的。Rho GTP酶家族调节肌动蛋白骨架，微管动力学，细胞极性和运动性，小泡运输路径以及细胞吸附、移动、增殖与生存［10－13］。在疟原虫入侵红细胞时，Rac GTP酶是红细胞骨架重组的动态调节因子［14］。肌动蛋白低聚体是红细胞骨架重要的结构组成部分，Rac1和Rac2调节肌动蛋白结构，在造血细胞中有许多重叠的和独特的功能［14］。Rho A被发现存在于红细胞的胞质和膜上，而且高度亲合性地结合于红细胞膜的胞质面上［15］。而在弓形虫入侵宿主细胞时，Rho GTP酶调控宿主细胞骨架的重组却未见文献报导。

为了解宿主细胞Rho GTP酶在弓形虫与疟原虫这两种原虫入侵过程中对宿主细胞骨架重组所起的调控作用，本研究选取Rho GTP酶家族中的Rho A和Rac1作为靶标蛋白，利用细胞免疫荧光的方法来检测弓形虫和疟原虫入侵宿主细胞后，宿主细胞Rho GTP酶在细胞内的分布情况。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 细胞株、虫株与实验动物 人呼吸道上皮细胞16－HBE购自上海复祥生物技术有限公司。SPF级KM鼠（18～22 g雌性鼠）购于南方医科大学实验动物中心。弓形虫RH株为本实验室保存，接种于SPF级KM鼠腹腔中传代。恶性疟原虫云南地理株由第四军医大学病原生物学教研室保存。

1．1．2 主要试剂 Trit on X－100、DAPI购于sigma公司；兔抗人Rac1和兔抗人Rho A单克隆抗体均购于 Cell Signaling公司；二抗 goat anti－rabbit Ig GFITC购于SANTA CRUZ公司。

1．2 实验方法

1．2．1 细胞爬片及涂片的制备

1．2．1．1 16－HBE细胞爬片制备及弓形虫感染放置4片盖玻片于六孔板内其中四孔，将16－HBE细胞平均分到此四孔中，用DMEM＋10%NBS培养基在37℃，5%CO2条件下培养至细胞覆盖率达95%～100%，细胞长在盖玻片上制备细胞爬片，方便下一步的免疫荧光实验操作与观察。从KM鼠腹腔中抽取弓形虫RH株速殖子，3 000×g离心5 min后弃掉上清液，加入4 m L DMEM完全培养基重悬虫体，混匀后均匀加入四孔16－HBE细胞爬片的培养孔中，37℃5%CO2培养箱中侵染2 h。吸掉细胞培养基上清，并用PBS洗涤细胞3次，洗去未侵染的弓形虫速殖子。

1．2．1．2 恶性疟原虫体外同步化培养和血涂片制备 恶性疟原虫复苏和传代培养参照Trager等的方法［16］进行。简述如下：以RPMI1640为基础培养基，其中含有25 mmol／L HEPES，0．2%Na HCO和10%人血清，红细胞压积2%～5%，在5%CO2和37℃条件下培养。每天换液一次、每隔3天添加一次新鲜人红细胞。选择疟原虫环状体较多的发育阶段开始同步化培养，待疟原虫同步化至成熟裂殖体为主且出现部分早期环状体阶段时，吸取适量悬浮红细胞，离心，留取适量上清，重悬红细胞制作薄血片，同时制作正常红细胞薄血片为阴性对照。血片自然晾干，4℃预冷无水乙醇固定10 min，冷风吹干，PAP笔划分实验区域待用。

1．2．2 细胞免疫荧光实验 室温条件下用多聚甲醛固定细胞爬片或红细胞涂片10 min，PBS振荡洗涤（5 min×3次），透化液（0．5%Tritonx－100，PBS稀释）500μL覆盖细胞后室温静置10 min。PBS振荡洗涤（5 min×3次），封闭液（0．1%Triton X－100，用新生牛血清稀释）500μL覆盖细胞并在37℃下孵育1 h。弃去封闭液，加入500μL一抗（封闭液稀释，稀释度1∶500），37℃孵育3 h。弃一抗，PBS振荡洗涤（5 min×3次）。加入500μL FITC标记的二抗 （封闭液稀释，稀释度1∶300）37℃条件下避光孵育1 h。在阴性对照实验中，细胞不用一抗孵育，仅以FITC标记的二抗（封闭液稀释，稀释度1∶300）孵育。以下过程均在避光条件下进行，PBS振荡洗涤（5 min×3次），10 n mol／L DAPI染色5 min，PBS振荡洗涤（5 min×3次），用双蒸水洗去玻片上的盐分。将玻片避光置于滤纸上风干，封片并在荧光显微镜下观察。

2 结 果

在荧光显微镜下用FITC滤光片观察可见，经抗人Rac1和Rho A单抗及FITC标记的二抗孵育后的16－HBE细胞内，在弓形虫纳虫泡膜上有荧光的丰度聚集（见图1－A和图1－C，黄色箭头所示）；阴性对照实验中，只用FITC标记的二抗与16－HBE细胞内孵育，在弓形虫纳虫泡膜上没有荧光的丰度聚集（见图1－E）；而在未被侵染的16－HBE细胞中，只见Rho A和Rac1 GTP酶在细胞质中的均匀分布（见图1－B和图1－D）。该实验结果表明在弓形虫入侵宿主细胞后，出现了宿主细胞的Rho A和Rac1 GTP酶聚集在弓形虫纳虫泡膜上的现象。然而，在用抗人Rac1和Rho A单抗孵育后的被恶性疟原虫侵染的红细胞中，疟原虫纳虫泡上没有看到荧光的聚集（见图2－A和图2－C，黄色箭头所示）；而在未被侵染的红细胞中只见Rho A和Rac1 GTP酶在红细胞中均匀分布（见图2－B和图2－D）。该实验结果提示在被恶性疟原虫感染的红细胞内的纳虫泡膜上未出现Rho A和Rac1 GTP酶聚集的现象。

图1 弓形虫RH株速殖子侵染16－HBE细胞后抗Rho A、Rac1单抗免疫荧光检测结果Fig．1 The immunofluorescence detection with anti－RhoA and anti－Rac1 mAb of 16－HBE cells infected with T．gondii RH tachyzoites

在绿色荧光显微镜下可见宿主细胞的Rho A和 Rac1 GTP酶在弓形虫纳虫泡膜上的高丰度聚集（Fig 1－A，和 Fig 1－C，黄色箭头所示），而在阴性对照实验组中，当细胞只与FITC标记的Ig G二抗孵育时，荧光没有在纳虫泡膜上聚集的现象（Fig 1－B，和 Fig 1－D）。

在绿色荧光显微镜下可见红细胞的Rho A和Rac1 GTP酶在恶性疟原虫（包括环状体、未成熟裂殖体和成熟裂殖体等阶段）纳虫泡膜上均没有聚集（Fig 2－A，和 Fig 2－C，黄色箭头所示），而在未被侵染的红细胞中只见Rho A和Rac1 GTP酶在红细胞中均匀分布（Fig 2－B，和 Fig 2－D）。

图2 恶性疟原虫裂殖子侵染人红细胞后抗Rho A、Rac1单抗免疫荧光检测结果Fig．2 The i mmunofluorescence detection with anti－Rho A and anti－Rac1 mAb of human erythrocytes infected with Plasmodium f alcipar um mer ozoites

3 讨 论

虽然弓形虫与疟原虫均属于顶复门的细胞内原虫，并以纳虫泡的形式在宿主细胞内寄生并增殖，但是两者入侵细胞及纳虫泡膜形成的过程却各有不同的特点。弓形虫对宿主细胞无特异的选择性，几乎可以感染所有的有核细胞。弓形虫入侵宿主细胞的过程是主动入侵，弓形虫以滑动的运动方式靠近宿主细胞膜，其类锥体紧密粘附于宿主细胞膜并向前推进，弓形虫棒状体与前端表膜融合后释放调控蛋白诱导宿主细胞表面形成丝状伪足和通道辅助其入侵，同时宿主细胞膜向内凹陷，虫体通过类锥体端进入细胞［17］。入侵部位的宿主细胞膜形成环状结构压缩包围虫体，入侵完成后宿主细胞膜封闭，纳虫泡形成［18－20］。在与宿主细胞的吸附过程中，弓形虫分泌的微粒体蛋白和棒状体颈蛋白形成的运动连接（moving junction，MJ）［21－22］是弓形虫吸附于宿主细胞的结构，且具有从纳虫泡膜中筛选宿主细胞膜组分的功能［23］。一些宿主细胞膜组分如与膜筏（membrane raft）、细胞骨架定位及分子多聚体形成相关的跨膜蛋白等，被迅速清除并在成熟的纳虫泡膜中消失，这些组分的排除可避免纳虫泡被内膜系统融合［24］，但许多膜脂却被保留下来。纳虫泡外表面还与宿主细胞的细胞器如线粒体、内质网紧密结合，这些细胞器的膜组分为纳虫泡的生长扩大提供膜组分来源［18－19］。纳虫泡膜的组分中，大部分来源于宿主细胞膜，少数来源于宿主细胞质，还包括弓形虫分泌的棒状体蛋白、微粒体蛋白、致密颗粒蛋白［18－19］。由此，弓形虫在入侵后在宿主细胞内形成了一个非融合小室—纳虫泡包围着虫体，来抵抗宿主细胞内涵体的酸化及溶酶体的融合作用，即防止被宿主细胞清除。

疟原虫裂殖子入侵红细胞则具有高度的宿主特异性，这是因为疟原虫是以配体－受体结合的方式来识别红细胞的［25］。疟原虫裂殖子入侵红细胞的过程开始于裂殖子与红细胞表面之间的微弱的吸附作用，是通过尚未鉴定的原虫配体与红细胞受体之间的相互作用，接着裂殖子的类锥体顶端与红细胞表面紧密结合［26－27］。裂殖子触发了与红细胞之间“连接（junction）”的形成，该连接在电子显微镜下显示为电子致密区，存在于裂殖子类锥体的一端。此外，裂殖子分泌棒状体蛋白进入红细胞，可能促进入侵的过程［27－29］。裂殖子最终通过原虫表面蛋白和原虫的肌动蛋白－肌球蛋白马达之间的相互作用，随着该“连接”向红细胞内的移动而进入红细胞［30］。因此，该“连接”的形成及其与原虫分子马达之间的相互作用是入侵的关键步骤［31－32］。而纳虫泡是由红细胞膜向细胞内流动而形成，与原虫进入红细胞的过程同步完成［29］，在入侵过程结束的时候，“连接”部分的电子致密区成为纳虫泡的一部分包裹着刚入侵的原虫［27］。

从弓形虫与疟原虫入侵宿主细胞的过程和纳虫泡形成过程来看，两者都具有很多的相同之处，如在入侵开始时，弓形虫速殖子和疟原虫裂殖子入侵宿主细胞都形成一个特殊的结构——“运动连接（moving junction）”，并在该连接处形成一个宿主细胞F－肌动蛋白环，激活宿主细胞骨架发生重组［2］；此外，两种原虫纳虫泡膜的组分大部分是来源于宿主细胞膜，小部分来源于原虫本身的分泌蛋白，而且还有一些来源于宿主细胞质。

弓形虫感染宿主细胞后，在纳虫泡膜上有宿主细胞Rho A与Rac1 GTP酶的聚集，这两种宿主细胞的酶类被纳入了弓形虫的纳虫泡膜上的方式有可能包括以下三种：1、随同宿主细胞膜一同被组成到纳虫泡膜上；2、通过扩散作用，从宿主细胞质中被组成到纳虫泡膜上；3、来源于与弓形虫纳虫泡膜紧密结合且作为纳虫泡扩大中主要膜成分来源的宿主细胞器如内质网、线粒体等。

尽管Rho AGTP酶被发现存在于红细胞的胞质和胞膜上，而且高度亲合性地结合于红细胞膜的胞质面上［15］，但是疟原虫纳虫胞膜上没有发现Rho A和Rac1 GTP酶聚集，这个现象有可能说明：1、红细胞膜上的Rho GTP酶并没有在纳虫泡形成时随着红细胞膜被纳入到纳虫泡膜上；2、细胞质中的Rho GTP酶也没有被组成到纳虫泡膜上；3、因为红细胞内没有内质网、线粒体等细胞器，因而也不可能通过膜融合的方式被组成到纳虫泡膜上。

尽管弓形虫、疟原虫的入侵过程需要宿主细胞骨架发生重组，而细胞骨架的重组又是由Rho GTP酶家族所调控，但是这个过程的具体细节仍是未知。宿主细胞Rho GTP酶在弓形虫速殖子与疟原虫裂殖子入侵宿主细胞时不同的分布现象，显示这两种原虫通过不同的途径来调节宿主细胞骨架重组。

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