微泡造影剂对高强度聚焦超声杀伤离体棘球蚴的增强作用＊

蔡 辉，张 静，2，叶 彬，2，赵毅峰，郭应兴，韩秀敏，张成武

棘球蚴病（echinococcosis）是细粒棘球绦虫的幼虫棘球蚴寄生所致的一种严重的人兽共患病。在我国，该病主要流行于西北的农牧区，严重影响着人畜健康并制约当地的畜牧业发展［1］。目前，传统的包虫病治疗主要有手术和药物治疗两种方式［2］，但各治疗方法仍存在不少问题需要解决，科研人员正积极探索新的治疗方法和手段。

高强度聚焦超声（high intensity f ocused ultrasound，HIFU）作为一种新兴的非侵入性治疗技术，已经用于实质性肿瘤的临床治疗。我们的前期研究发现，HIFU辐照棘球蚴对囊液内的原头蚴有肯定的杀伤效果，但一定功率的HIFU辐照并不能完全杀灭原 头 蚴［3－4］。超 声 造 影 剂 （ultrasound contrast agent，UCA）通过增加靶区组织内空化核的数量，增强HIFU的消融作用［5－6］。本实验就超声造影剂能否增强高强度聚焦超声对离体细粒棘球蚴的治疗效率进行了探讨。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 主要仪器 JC型高强度聚焦超声肿瘤治疗系统由重庆医科大学超声工程研究所研发、青海大学附属医院提供。该系统主要由可调功率发生器、治疗头、B超监控系统（系统自带灰度分析软件）、机械运动控制系统和治疗床等部分组成。治疗头工作参数如下：频率1．0 MHz，功率0～400 W，连续可调，探头直径150 mm，焦距为110 mm。

1．1．2 主要试剂 超声造影剂由重庆医科大学附属第二医院超声影像学研究所提供（经消毒处理，微泡直径2．0～5．0μm）；0．25%台盼蓝溶液（台盼蓝为美国Gibco公司产品，以PBS溶液稀释过滤，终浓度为0．25%）；灭菌注射用生理盐水及其他试剂均为国产。

1．1．3 棘球蚴标本 感染棘球蚴的羊肝采自青海省西宁市某屠宰场。

1．2 方法

1．2．1 标本的选取和处理 感染细粒棘球蚴的羊肝取出后立即放入冰盒送往实验场地。用生理盐水洗净羊肝表面血迹，B超检测病灶大小，选取形状为球形或近似球形，直径20～50 mm，囊壁较薄，触之柔软的细粒棘球蚴作为实验材料。将之修整成50 mm×50 mm×50 mm大小的正方体，浸于生理盐水中，并在－0．05～－0．1 MPa的压力下常规脱气30 min。

1．2．2 实验分组 根据包囊的直径（近似球形包囊根据长轴，以下统称直径）分为6个不同的区组：I：20～25 mm直径大小的包囊；Ⅱ：25～30 mm直径大小的包囊；Ⅲ：30～35 mm直径大小的包囊；Ⅳ：35～40 mm直径大小的包囊；Ⅴ：40～45 mm直径大小的包囊；Ⅵ：45～50 mm直径大小的包囊。每组包囊25个。同一直径区组的包囊每5个为一试验组，随机接受以下试验：A组：普通B超照射的空白对照，B组：0．1 m L UCA 处理，C组：单纯 HIFU辐照，D 组：0．1 m L UCA＋HIFU 辐照，E 组：0．2 m L UCA＋HIFU辐照。

1．2．3 超声造影剂的处理及使用 用生理盐水溶解超声造影剂，震荡摇匀。溶解后微泡浓度约为1×109个／m L，直径3．5～4．5μm，分布均匀。用1 m L无菌注射器抽取含有混匀UCA的生理盐水，经肝组织穿刺入包囊内，抽取少量囊液，混匀，反复抽吸3次，然后将液体全部注入包囊内，最后缓慢退出注射器，尽量避免漏液。

1．2．4 HIFU辐照 治疗靶区为超声所显示的病灶。实时监测下对治疗区域进行定位、扫描。治疗扫描方式为点扫射，扫描速度3 mm／s，每个点扫描3次，每次3 s，层间距5 mm。治疗功率为150 W。治疗时间不等，由包囊大小决定。

1．2．5 治疗前后灰度比较 包囊的每个层面治疗结束后，肉眼观察监控图像所示灰度变化，并立即用系统自带灰度分析软件分析靶区治疗前后的灰度变化。

1．2．6 台盼蓝染色检测原头蚴死亡率 辐照后立即抽取囊液，混匀，取一滴囊液与0．25%的台盼蓝按照1∶1的比例涂片，每个包囊涂片3张，染色2 min，低倍镜下每张玻片随机计数200个原头蚴，每个包囊共计数600个原头蚴，统计其中活原头蚴数目（活原头蚴拒染呈透明状，偶见收缩蠕动；死原头蚴被染成蓝色）。原头蚴死亡率计算公式为：死亡率＝（1－活原头蚴数／总原头蚴数）×100%。

1．2．7 统计学方法 采用PASW 18．0统计软件包进行统计学分析，所有数据均用±s）表示。统计结果用随机区组资料方差分析，检验标准P＜0．05。

2 结 果

2．1 超声灰度改变 B超监控观察到单纯UCA组灰度无变化（图1B），单纯HIFU辐照引起包囊边缘回声加强，内部少量均匀增强（图1C），UCA协同HIFU辐照能使包囊边缘回声加强和内部团状回声增强，该增强比单纯HIFU辐照明显，并且变化程度随加入UCA量的增加而增强（图1D，1E）。

图1 各种处理方式处理后B超监控图像Fig．1 The ultrasonic i mages of hydatid cysts after different treat ments of HIFUA：Control，the hydatid cyst presented clear margin and intranodular unifor m echogenicity；B：Treated with 0．1 m L UCA alone，there was no difference compared with group A；C：Treated with HIFU alone，the echo of hydatid cyst enhanced in ri m－like style and the inside region was ho mogeneously enhanced；D：Treated with 0．1 m L UCA＋HIFU，the echo of hydatid cyst enhanced in ri m－like style and the inside region was bolus－likely enhanced；E：Treated wit h 0．2 m L UCA＋HIFU，the echo of hydatid cyst enhanced in ri m－like style and the inside region was bolus－likelt enhanced．Further more，the enhancement was more obvious than that of group D （the treated areas were sho wn by green curves）．

用自带的灰度分析软件比较并记录治疗前后靶区的灰度改变值，数据（表1）表明单纯UCA组的灰度增强无统计学意义（P＞0．05），单纯 HIFU辐照能引起灰度增强（P＜0．01），UCA协同HIFU辐照能使灰度增强更为明显，且灰度增强值随加入UCA量的增加而增大，差异有统计学意义（P＜0．01）。同时，加入同一剂量的UCA，如果包囊直径相差很大，灰度增强值也存在差别，差异有统计学意义（P＜0．01），如果直径相差不大，加入同样剂量的UCA，灰度增强值无明显差异（P＞0．05）。这就说明UCA协同HIFU辐照能增加靶区灰度增强，并且该增强的强度与UCA的剂量和包囊内囊液的体积的比例存在一定的关系。

表1 各种处理方式处理后超声灰度改变值Tab．1 Changes of ultrasonic gray scale of cysts after different treat ments of HIFU

2．2 棘球蚴囊液内原头蚴的死亡率 方差分析经各种处理后棘球蚴囊液原头蚴的死亡率（表2），除单纯UCA组外（P＞0．05），其余处理组差别有统计学意义（P＜0．01），即单纯加入UCA并不能增加原头蚴死亡率，HIFU辐照能增加原头蚴死亡率，UCA协同HIFU照射能增加HIFU对原头蚴的杀伤率，且杀伤率随着UCA剂量的增加而加强。加入同样剂量的UCA，如果包囊直径相差很大，原头蚴死亡率有统计学意义（P＜0．01），如果直径相差不大，加入同样剂量的UCA，原头蚴死亡率变化不大（P＞0．05）。这就说明UCA可提高 HIFU对离体细粒棘球蚴囊液内原头蚴的杀伤率，并且与UCA的剂量和包囊内囊液的体积存在一定的关系。

表2 经各种HIFU处理后棘球蚴囊液原头蚴的死亡率（%）Tab．2 Instant death rate of protoscolices of hydatid after different treat ments of HIFU（%）

2．3 原头蚴的形态观察 染色后普通光学显微镜下观察。对照组与单纯UCA组：原头蚴形态结构正常，内部小钩、钙颗粒等结构清晰可见，拒染呈透明状（图2 A，2B）。单纯 HIFU组：部分原头蚴死亡，台盼蓝着色，形态结构基本正常，未见被膜破坏，内部结构隐约可见（图2C）。0．1 m L UCA＋HIFU辐照组：原头蚴缩小变圆，深染色，内部结构不清（图2D）。0．2 m L UCA＋HIFU辐照组：大部分原头蚴死亡，被膜破坏，可见被膜碎片及大量小钩、钙颗粒（图2E）。

图2 各种处理对原头蚴结构的影响（台盼蓝染色，×100）Fig．2 The influence of different treat ments on structures of protoscolices（Tr ypan blue exclusion assay，×100）A：Control，alive protoscolices were not stained in blue and their str uct ures were clear；B：Treated with UCA alone，there was no any difference co mpared with group A；C：Treated with HIFU alone，some of protoscolices dead and dead ones were stained in blue and their structures were relatively clear；D：Treated with 0．1 m L UCA＋HIFU，dead protoscolices rounded to s maller sizes，and they were stained in blue deeply and their str uctures inside were indistinct；E：Treated with 0．2 mL UCA＋HIFU，protoscolices were broken into pieces，the numerous hooklets and calcareous bodies were scatted（shown as the arrow）．

3 讨 论

HIFU利用超声发射器分散发射高能超声波，并在体内将超声波能量聚焦在选定的脏器组织区域，通过热效应、空化效应和机械效应消除病灶而对焦点周围组织没有明显影响［7］。实验证明，HIFU辐照棘球蚴对囊液内的原头蚴有一定的杀伤效果，并且对囊壁的角皮层和生发层有破坏作用，从而使棘球蚴停止生长并逐渐退化［3－4］，但一定功率的 HIFU辐照并不能完全杀死原头蚴，这可能是因为细粒棘球蚴与实质性肿瘤明显不同，其囊内充满囊液，HIFU照射聚焦囊内不会产生瞬间高温，达不到完全杀灭原头蚴效果。若不能使超声能量在囊液中大量沉积而使囊液中的原头蚴、子囊、孙囊完全死亡，残存的活原头蚴等有引起棘球蚴病复发的可能。提高HIFU治疗剂量（提高HIFU治疗功率或延长治疗时间）虽可全面彻底地覆盖病灶，增加囊液内原头蚴的死亡率，但也会带来一系列副作用，如增加对正常组织的损伤，延长治疗时间，增加麻醉意外发生的机率等［5］。

理想的HIFU增效剂应具备以下特点：安全无毒副作用；给药方便；在活体组织内药效持续稳定，生物利用度高。超声造影剂主要用于临床诊断，沙卫红［5］、计晓娟［6］等的研究证明 UCA 能通过增强空化效应从而增加HIFU的治疗效率，研究认为UCA微泡爆破改变了组织对入射声波的反应，引起靶区能量聚集［8］，即超声作用与“空化核”（微气泡）在极短的时间内产生微观的剧烈反应，释放出比原超声辐照能量高出数倍的能量，从而增强HIFU杀伤效应。

本实验观察到单纯HIFU照射能引起靶区灰度增强和增加原头蚴的死亡率，这与王俊安、邹晓毅［3－4］等人的研究结果一致，说明 HIFU 辐照对原头蚴有一定的杀伤作用，即HIFU辐照对囊型包虫病有一定的治疗作用。单纯加入UCA并不能引起靶区灰度改变和增加原头蚴死亡率，但加入一定量的UCA协同HIFU照射能增加灰度增强和原头蚴的死亡率，并且该变化与加入UCA剂量成正比。同时，若UCA剂量一定，该变化与包囊直径呈反比。说明UCA能增强HIFU对细粒棘球蚴的杀伤效应，并且与囊液的体积和UCA剂量存在一定的关系。加入足量的UCA协同HIFU照射能破坏原头蚴的结构，能使部分原头蚴的包膜碎裂，这与孔璟［P］等人的研究结果一致，分析原因，认为UCA通过增强HIFU辐射的空化效应，破坏细胞膜的结构，增加细胞膜的通透性，从而增加原头蚴的死亡率，提高HIFU对细粒棘球蚴的治疗效率。

本实验在不增加HIFU治疗剂量的前提下，利用UCA增强了HIFU对离体细粒棘球蚴的杀伤效应，为进一步研究HIFU杀伤实验动物体内细粒棘球蚴奠定了基础。但是，如何在穿刺注入UCA时防止囊液的外漏从而预防继发感染还是一个亟待解决的问题。另外，HIFU辐照最佳功率以及加入UCA的剂量与囊液体积的最佳比例也需要进一步探索，以便优化治疗参数，减少对病灶周围正常组织的损伤，达到最佳治疗效果。

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