羊口疮病毒F1L蛋白二级结构分析与表位预测＊

王光祥，尚佑军，吕占禄，张克山，田 宏，刘湘涛

羊口疮（Orf）是由羊口疮病毒（Orf vir us，ORFV）引起反刍动物，主要以引起绵羊和山羊感染为主的一种急性、高度接触性人兽共患传染病［1－2］。ORFV主要感染羔羊和幼羊，主要以口唇、舌、鼻等部位形成丘疹、水疱、脓疱和痂皮为特征，羔羊常因继发感染而死亡，给养羊业造成巨大的经济损失，并对人类健康构成威胁［2－5］。

ORFV属于痘病毒科副痘病毒属，病毒粒子长220～250 n m，宽125～200 n m，表面结构为管状条索斜形交叉“8”字形缠绕线团状。ORFV基因组为线性双股DNA，全长130～150 kb，病毒基因组中间是一个长的中心编码区，两头是相同的反向末端重复序列［6－7］。现在大多数学者公认CPDV有16个开放性阅读框架（ORF），130个基因，在127个双股线性基因中，有88个基因是高度保守的。可变区大多数位于基因的末端，中间基因相对保守［6－8］。包括末端基因区和中间核心区。F1L基因位于病毒基因组中部，其编码产生的39 k Da蛋白是病毒表面微管的组成成分之一，并且能诱导宿主产生中和抗体［9］。此外，该蛋白具有肝素结合活性，能够与表达于大多数哺乳动物细胞表面的硫酸乙酰肝素（Heparansulfate，HS）受体结合，因此该蛋白被认为在病毒吸附和侵入过程中起到重要作用［10］。Gallina等［11］研究证实F1L蛋白能够刺激机体中和抗体的产生，同时也能介导细胞免疫，因而该蛋白被认为是刺激机体产生免疫应答的主要免疫原蛋白，同时也被认为是ORFV亚单位疫苗研制的候选抗原。因此，研究F1L蛋白对羊口疮的诊断和免疫具有重要意义。

现代生物信息学的迅猛发展，为我们提供了一种高效、快速预测表位的方法，但以往表位预测多采用单参数预测，有其局限性，随着生物信息学的发展及其网络数据库的扩展，多参数综合预测已成为当前表位预测的主流［12］，可大大提高预测的准确性。本研究以ORFV F1L靶抗原，预测其二级结构、信号肽、优势的B细胞表位和T细胞表位为ORFV后续的诊断和免疫研究提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 氨基酸序列 选取ORFV F1L蛋白全长共340个氨基酸（氨基酸序列来自本实验室测序），序列如下：MDPPEITAYIIGVAEGRGTKEVFPTLP YLVGLADDPPKPQPAPAPSPAPAPAPAPAPS PAPAPAPKPSPPAPHPKGDHVLKAVEWKDV DSKDYPHFFTDMCKSTCPKEMQRRAAH HLN L WESISAGTVSTKYSDNDFILVVDNDMTFRKP EMVKPLIEA MKTNGWY MAQLKETY MTGAL ATNVPGTGDPEL MVYPGGYDVSLDAYITNV GGMKKLYDAIIKDGGLRGGLLTEVFTLEKRL SLARVVLSGAEQVVYPEYYIQVKTRLGGAP SL WSLLAT WLARF WPGAIYFLTTPLFSFMG LFDVDVVDVFILAYLLVLVLLLPNSRLL WFIA GLLVTAIV。

1．2 方法 应用生物信息学相关软件和生物信息学网站，分析ORFV F1L蛋白的功能基序、表位类型、功能定位、信号肽二级结构等；所用生物信息学网站有：蛋白二级结构预测网站：http：／／npsapbil．ibcp．fr／cgi－bin／npsa＿auto mat．pl？page＝／；信号肽预测网站：http：／／www．cbs．dt u．dk／ser v－ices／Signal P／；B细胞表位预测网站：http：／／www．i mtech．res．in／raghava／abcpred；细胞毒性 T 细胞（CTL）表位预测网站http：／／www．i mtech．res．in／raghava／nhlapred；辅助T细胞（Th）抗原表位的预测网站：http：／／www．i mtech．res．in／raghava／pr opred／；生物信息学软件有：DNAStar Laser gene7程序包的Pr otean软件，在线软件Signal P 4．0。

2 结 果

2．1 ORFV F1L蛋白的二级结构 用SOPMA［13］服务器预测ORFV F1L蛋白的二级结构结果如图1所示，ORFV F1L蛋白的二级结构主要包括α－螺旋、β－转角、无规则卷曲和β－片层4种类型，分别为α－螺旋34．71%、β－片层18．82%、β－转角5．88%%、无规则卷曲40．59%。整个结构中α－螺旋区域和无规则卷曲区域出现的较多，这有利于维持病毒膜蛋白的稳定性。β转角及无规则卷曲是比较松散的柔性结构，该区域常含有B细胞的优势表位［14］。F1L蛋白的无规则卷曲和β转角即功能区主要位于第1—5、14—27、33—77、86—93、104—106、125—136、143—149、162—165、177—190、195—201、222—229、248—150、255—258、264—265、267—269、282—287、292—294、300—304、322—326位氨基酸（图1）。

图1 ORFV F1L蛋白二级结构预测结果h：α－螺旋，t：β－转角，c：无规则卷曲，e：β－片层Fig．1 Secondary structure prediction oforFV F1L protein h：Alpha helix；t：Beta turn；c：Random coil；e：Extended strand．

2．2 ORFV F1L蛋白信号肽预测 使用在线软件Signal P 4．0，利 用 神 经 网 络 法 （Neural net wor k，NN）［14］预测ORFV F1L蛋白序列中是否存在潜在的信号肽。在线软件Signal P 4．0预测结果显示ORFV F1L蛋白没有信号肽，预测结果如图2。

图2 F1L蛋白信号肽预测结果Fig．2 The signal peptide analysis of F1L

2．3 ORFV F1L蛋白B细胞表位多参数预测 使用DNAStar Lasergene7程序包的Protean软件提供的模块对ORFV F1L蛋白进行多参数预测，选择Kyte－Doolittle法预测蛋白的亲水性；Emini法预测蛋白的表面可及性；用Karplus－Eisenberg法分析蛋白的柔韧性；用Jameson－Wolf法预测蛋白的抗原指数见图3。将ORFV F1L蛋白单参数预测结果进行综合分析后发现，同时有3种或以上参数预测的表位肽段：1—4、16—19、34—49、55—78、129—134、143—152、169—174、186—188、210—214位氨基酸可能存在的B细胞表位（表1）。最后将单参数预测综合分析结果采用ABCpred［13］方案（窗口长度16，阈值0．51）进行筛选、验证，发现ORFV F1L蛋白的 9—24、30—45、54—69、128—143、136—151、167—182和207—222等区段可能存在优势B细胞表位（表2）。

表1 不同方案预测ORFV F1L蛋白B细胞表位的肽段位置Tab．1 B cell epitopes for ORFV F1Lpredicted by various methods

表2 ABCpred方案预测初筛肽段的结果Tab．2 The score of the peptides obtained by preliminary prediction with ABCpred program

图3 F1L亲水性分析Fig．3 Hydrophilicity analysis of F1L

图4 F1L表面可及性区域Fig．4 Surface probability regions of F1L

图5 F1L柔韧性区域Fig．5 Flexible regions of F1L

图6 F1L抗原指数分析Fig．6 Antigenic index of F1L

2．3 ORFV F1L蛋白T细胞表位预测

2．3．1 ORFV F1L蛋白CTL表位预测 在网络平台输入ORFV F1L蛋白序列，运用ANNs＋QM法（神经网络＋量化矩阵法）［16］分别预测 HLA－A2、HLA－A＊0201、HLA－A＊0202、HLA－A＊0203、HLA－A＊0205的分子结合肽，阈值设为0．5，结果见表3所示。综合分析ORFV F1L 228—236位的GLLTEVFTL，310—318 位 的 FILAYLLVL 为ORFV F1L蛋白的CTL表位。

表3 CTL抗原表位预测Tab．3 Prediction for CTL epitopes oforFV F1L

2．3．2 ORFV F1L蛋白Th表位的预测 使用在线程序，对ORFV F1L蛋白的Th表位进行预测［17］，预测 DRB1＿0101、DRB1＿0102 、DRB1＿0301 3种不同类型，预测结果见表5。综合分析0RFV F1L的51段3类结合肽，有3段结合肽为3类结合肽等位基因所共有，即317—325位的 VLIQTTAEA、318—326位的 VLLLPNSRL和308—316位的VFILAYLLV为ORFV F1L的Th表位。

3 讨 论

本研究借助于计算机网络技术和生物学软件对ORFV F1L蛋白的二级结构，信号肽和潜在的T、B淋巴细胞抗原表位进行了预测和分析。分析结果表明该蛋白形成α螺旋结构的能力较强，β折叠较少，这可能与该蛋白的氨基酸组成有关。蛋白二级结构中的α－螺旋、β折叠的化学键能较高，能较牢固地维持蛋白的高级结构，但很难较好地与抗体嵌合，且经常处于蛋白质内部，因而很少成为抗原表位。但是该蛋白具有较多的β转角和无规则卷曲结构单元，这些结构易于扭曲、盘旋并展示在蛋白表面，有利于抗体嵌合，常含有B细胞优势抗原表位［15，18］。

信号肽为分泌蛋白在通过膜时N末端所含作为信号的氨基酸序列，常由15～25个氨基酸构成，N端含少量的碱性氨基酸，主要含不携带电荷的疏水性氨基酸，在蛋白成熟后信号肽序列将被剪切、去掉。通过预测信号肽可以避免预测出的表位落在信号肽区，预测结果显示ORFV F1L蛋白没有信号肽。

目前，已有几十种预测B细胞抗原表位的算法，其中，亲水性、可及性、柔韧性及抗原性方案的预测效果相对较好［18］。基于人工神经网络算法的ABCpred方案，预测准确率最高可达65．9%［15］。本文综合这些方法对ORFV F1L蛋白潜在的B细胞抗原表位进行预测和分析。ABCpred方案预测ORFV F1L蛋白中的B细胞表位分值的范围在0．66～0．84之间，用单参数和二级结构筛选出的肽段在用该方法的预测结果中均可找到相对应的片段。本研究推测ORFV F1L蛋白最可能的B细胞优势抗原表位分别位于其N端氨基酸残基第9—24、30—45、54—69、128—143、136—151、167—182和207—222等区段。

表4 Th表位的预测Tab．4 Prediction for Th cell epitopes oforFV F1L

CTL表位是经抗原提呈细胞处理提呈的一种抗原蛋白，它与MHC－I类分子结合，被T细胞抗原受体（TCR）特异性识别从而诱导相应的CTL发生免疫应答的短肽，它一般含8～10个连续氨基酸，活化并决定了CTL特异性杀伤效应［16，19］。预测CTL表位，常用结合基序法、人工神经网络法和蛋白酶体矩阵法，本研究采用最为高效、准确的人工神经网络法结合量化矩阵法，选择HLA－A2、HLA－A＊0201、HLA－A＊0202、HLA－A＊0203、HLA－A＊0205 5类31段结合肽，来综合预测ORFV F1L蛋白的CTL表位。结果显示ORFV F1L蛋白的228—236位的 GLLTEVFTL，310—318位的FILAYLLVL两段结合肽为各类所共同预测。该肽段可与MHCI类分子结合形成复合物呈递给免疫细胞，进而调控激活CTL细胞的细胞毒作用。

Th表位是识别外源蛋白（如细菌、病毒抗原和免疫接种的蛋白等）经加工后与MHC II类分子结合的抗原表位（外源性抗原T细胞表位）。外源蛋白被APC捕获送入溶酶体裂解成一定肽段后，在HLA－DM分子帮助下，消除由Ii链引导进入溶酶体的MHCII类分子上的Ⅱ类分子Ii链相关肽（CLIP），使得肽段中的T细胞表位进入MHC II类分子凹槽与之结合形成抗原肽－MHC II类分子复合体，再易位至APC表面，被CD4＋Th细胞识别，激活Th细胞以辅助B细胞产生抗体。活化的细胞还产生一些细胞因子，介导NK细胞等免疫细胞产生细胞免疫应答。MHC－Ⅱ类分子呈异源双体，包括α、β两条链，分别有α1、α2和β1、β2结构域，其中α1和β1组成与两端开放的抗原肽结合深槽。MHC－Ⅱ类分子结合槽底部呈微小锯齿形排列，形成9个“小袋”样结构，可与相应结合肽上的氨基酸结合［20］。相对应的结合肽两端的氨基、羧基可有一定的延长，从13～34个氨基酸不等。本研究利用MHC－II类分子结合肽在线程序，预测了ORFV F1L蛋白的DRB1＿0101、DRB1＿0102、DRB1＿03013种不同等位基因的Th表位。预测结果显示0RFV F1L的51段3类结合肽，有3段结合肽为3类结合肽等位基因所共有，即317—325位的 VLIQTTAEA、318—326位的 VLLLPNSRL和308—316位的VFILAYLLV氨基酸短肽。它们可与MHCII类分子结合，被抗原递呈细胞转运至细胞表面与T细胞受体识别结合，起到协调体液免疫和细胞免疫应答的作用。［17，20］。

本研究依靠生物信息学网络平台和生物软件分析了ORFV F1L的二级结构，预测了B细胞抗原、HLA抗原肽、MHC结合肽等。为该蛋白的体外表达及用于ORFV的免疫诊断和疫苗研制提供理论依据。

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